سرولوژي

 آزمونهاي سرولوژيکي ممکن است در تشخيص يک ويروس ناشناخته، روش نهايي و قطعي باشد. همچنين در مطالعه ارتباطات بين جدايه ها و يا نژادهاي مرتبط اهميت دارند. اين آزمونها بر اساس ظرفيت اتصالي که آنتي باديها با آنتي ژنهاي اختصاصي خود دارند، ميباشند. آنتي ژن (پادگن) ماده اي است که قادر است به هنگام وارد شدن به بدن جانور مناسب، واکنش ايمني ايجاد کند. به توانايي يک آنتي ژن به ايجاد پاسخ ايمني به ايمونوژيستي موسوم است و موادي که موجب اين پاسخ ايمني ميشوند ايمونوژن گفته ميشوند. اغلب ويروسهاي گياهي وقتي به بدن جانور مناسب مثل (خرگوش ،موش، اسب) و يا پرنده ( مرغ و يا بوقلمون) تزريق ميشوند، آنتي ژن موثري هستند و ميتوانند توليد آنتي بادي را تحريک کنند. از آنتي بادي توليد شده در آزمونهاي مختلف سرولوژيکي استفاده ميشود.  به سرم خون که حاوي آنتي بادي است، آنتي سرم گفته ميشود که از بقيه اجزاء خون جدا ميشود. ويروس کاملاً خالص براي تهيه آنتي سرمها لازم ميباشد. در غير اينصورت آنتي سرم تهيه شده حاوي مقادير زيادي آنتي بادي در مقابل پروتين گياه ميزبان نخواهد بود. آنتي سرم را ميتوان با تزريق سوسپانسيون ويروس خالص، درون رگ و يا در عضله جانور مورد آزمايش تهيه کرد. تعداد تزريقها بر اختصاصي بودن آنتي سرم توليد شده اثر دارد. اگر فقط يک يا دو تزريق انجام شود، فقط آنتي باديها در برابر تعيين کننده هاي آنتي ژنيک اصلي¹ توليد ميشوند و در نتيجه آنتي باديها خيلي اختصاصي خواهند بود. اگر شش بار يا بيشتر تزريق صورت گيرد، آنتي باديها يي در برابر تعيين کننده هاي آنتي ژنيک و فرعي به وجود خواهند آمد و آنتي سرمي با دامنه وسيع تر توليد خواهد شد. و اين آنتي باديها به طور اختصاصي با ناحيه کوچکي از آنتي ژنها واکنش ميدهند.

 خواص فيزيکو شيميايي آنتي بادي

آنتي باديها يا ايميونوگلوبين ها، پروتئينهاي Y شکل ميباشند، كه دو نوع ايميونوگلوبين با ويروس شناسي گياهي ارتباط دارند. نوع اول که توسط آنتي ژن، پس از برانگيخته شدن، توليد ميشود و IgM نام داردکه در اکثر موارد بعد از دو هفته ناپديد ميشود. IgM پنتامري است با ملکولهاي بزرگ 800-900 کيلو دالتوني که داراي ضريب رسوب حدود S19 ميباشد. ملکول گاما گلوبيني که از نظر سرولوژي مهم است IgG با وزن ملکولي حدود 150 کيلو دالتون و ضريب رسوب S5/6 ميباشد. IgG مرکب از دو زنجيره دراز يا سنگين با وزن ملکولي 70-50 کياو دالتون و دو زنجيره کوتاه يا سبک با وزن ملکولي حدود 23 کيلو دالتون ميباشد. اين آنتي باديها داراي طولي تقريباً 10 نانومتر هستند، که برابر با يک سوم قطر ذره اکثر ويروسهاي کروي شکل و تقريباً برابر با عرض تعدادي از ويروسهاي دراز ميباشند .

شکستن آنتي باديها به قطعات F توسط آنزيمها امکان پذير است. هر آنتي بادي داراي دو محل متغيير و مخصوص براي پيوند با آنتي ژن در قسمت F_ab است. قسمت F_C غير قابل تغيير بوده و در بسياري از آزمونهاي سرولوژيکي بسيار مهم ميباشند. اگرچه قسمت F_C براي آنتي ژن تحريک کننده آنتي بادي، غير اختصاصي است اما براي حيواني که در آن، اين قسمت F_C  توليد شده است اختصاصي است. اين قسمت به نوبه خود زماني که به يک حيوان ديگر وارد بشود، توليد آنتي بادي اختصاصي اين آنتي بادي را تحريک ميکند.
 

انتقال ويروسهاي گياهي

هيچ ويروسي به خودي خود از گياه خارج نميشود و به وسيله آب، باد و عوامل ديگري نظير اينها انتقال نمي يابد. انتقال ويروس در طبيعت بيش از هر پاتوژني به موجود زنده وابسته است. ويروسها ميتوانند از طريق ازدياد گياهان به وسيله قلمه، پيوندک، پاجوش، غده و يا از راه مکانيکي و يا حشرات انتقال پيدا کنند. به موجود زنده اي که ويروس را از منبع آلوده کسب کند و تحت مکانيسم خاص به گياه سالم انتقال دهد، اصطلاحاً ناقل[1] ميگويند. امروزه مشخص شده که تعدادي از شکم پايان، کنه ها، نماتد ها وقارچها نيز، ناقل ويروسهاي گياهي ميباشند (6 ،3 ).

 

2-4-2- حرکت ويروس در گياه

براي ايجاد آلودگي در گياه ويروس بايستي از سلولي به سلول ديگر حرکت کند. ويروس در گياه به دو صورت حرکت ميکند، حرکت اول کند بوده و در اين حركت ويروس از راه پلاسمو دسماتا[2] از سلولي به سلول ديگر انتقال مي يابد که اين نوع حرکت در ابتداي آلودگي گياه به ويروس انجام ميگيرد. سرعت حرکت ويروس بسته به نوع سلول، سن سلول، و نوع ويروس فرق ميکند. حرکت ويروس در سلولهاي جوان و بلند سريعتر از سلولهاي کوتاه و پير است. همچنين سرعت حرکت آنها در حرارت بالاتر بيشتر از حرارتهاي پايين است. علت اين اين امر شايد به خاطر زياد شدن حرکت پروتو پلاستي و فعاليتهاي سلولي  باشد. حرکت دوم سريع ميباشد و در اين حالت ويروس غالباً از راه آوندهاي آبکش و احتمالاً در سلولهاي غربالي آنها به حرکت در ميآيد. سرعت حرکت ويروس در آوندهاي آبکش در شش دقيقه آول آلودگي 15 سانتي متر است (3،6، 11).

 

2-5- خصوصيات اصلي برخي از ويروسهاي سيب زميني

2-5-1- PLRV

ويروس لوله اي شدن برگ سيب زميني[3]يكي از مهمترين ويروسهاي سيب زميني ميباشد که به نامهاي ويروس نكروز بافت آبكشي، پيچيدگي برگ سيب زميني و نكروز شبكه اي سيب زميني معروف است (27 ). اين بيماري نه فقط باعث كاهش قابل ملاحضه اي در محصول ميشود، بلكه سبب نكروز غده ها نيز ميشود (7، 19، 20). احتما لاً اين ويروس مهمترين ويروس سيب زميني ميباشد.

علائم : اين ويروس هيچ علائمي بر روي گياهان كشت بافتي كه به وسيله اين ويروس تلقيح شده باشند ايجاد نميكند (49). گياهاني كه از غده آلوده اين ويروس به وجود ميآيند كوتوله و رنگ پريده هستند و داراي رشد عمودي ميباشند. همانطور كه نام اين بيماري نشان ميدهد برگها بخصوص برگهاي پاييني لوله اي ميشوند و چون اين ويروس در آوند آبكش فعاليت ميكند بنابراين تجمع آن در آوند آبكش باعث عدم انتقال مواد ساخته شده در برگها، به ريشه شده و ميزان كربوهيدراتها در برگها بالا رفته و در نتيجه خشبي و شكننده ميشوند. اولين علائم بيماري حدود يك ماه پس از كاشت و يا هنگامي كه رشد بوته ها به 15 سانتي متر رسيد مشاهده ميشود. بوته هاي بيمار غده هاي كمتر و كوچكتري نسبت به گياهان سالم توليد كرده و در نتيجه ميزان محصول كاهش مي يابد. گياهاني كه در طول فصل رويشي آلوده ميشوند، در صورت نشان دادن علائم كوتولگي داراي علائم خيلي مختصري خواهند بود. آلودگي در ابتداي فصل موجب لوله اي شدن مشخص برگچه هاي انتهاي بوته ميشود و در قاعده برگچه هاي جوان نيز مواد ارغواني رنگ ممكن است به وجود آيند (4).

مشخصات پيكره ويروس : ويروس لوله اي شدن برگ سيب زميني يک لوتئو ويروس[4]از خانواده لوتئو ويريده ميباشد، كه پيكره هاي ايزومتريك آن26-24 نانومتر قطر دارند و به صورت شش وجهي ميباشند. 28% پيكره ويروس شامل ژنوم RNA تك رشته اي با وزن مولكولي210 دالتون و 72% آن شامل پوشش پروتيني به وزن 3/26 كيلو دالتون ميباشد. اين ويروس داراي 5987 نوكلئوتيد و RNA ساب ژنومي آن داراي 2300 نوكلئوتيد ميباشد (60)، كه پوشش پروتيني اين ويروس را كد ميكند و از 180 زير واحد تشكيل شده است (41).

ميزبانها : در طبيعت سيب زميني ميزبان اصلي PLRV است و اكثر ميزبانهاي اين ويروس در خانواده سولاناسه واقع شده اند. برخي از گياهان ميزبان خانواده سولاناسه اين ويروس عبارتند از Solanum dulcamara,S.Villosum,Datura stramanium,D.tatula كه علائمي شامل كوتولگي ،كلروز، لوله اي شدن برگها ونكروز بافت آبكشي را ايجاد ميكنند. از ميزبانهاي غير سولاناسه اي اين ويروس ميتوان     Amaranthus caudatus,Celori argentea  ,Gomphrena globosaرا نام برد.

انتقال : اين ويروس مانند اغلب ويروسهاي سيب زميني از طريق غده منتقل ميشود. اين ويروس به طريقه مكانيكي منتقل نميشود (46). به دليل تجمع و انتشار PLRV به سلولهاي آوند آبكشي،اين ويروس در بافت اپيدرم گياه يافت نميشود. تنها روش انتقال آن پيوند و استفاده از ناقلين است. چندين شته اين ويروس را از طريق پايا و گردشي منتقل ميكنند،كه از مهمترين آنها ميتوان شته سبز هلو[5]  را نام برد. ازشته هاي ديگر ناقل اين ويروس ميتوانAphis nasturtii , Aphis faba, را نام برد.

 

2-5-2- PVY

ويروس Yسيب زميني از مهمترين ويروسهاي سيب زميني ميباشد، كه در سراسر جهان خسارتهاي زيادي را وارد ميكند. ميزان خسارت آن بسته به نژاد ويروس به 100%هم ميرسد. اين ويروس به نامهاي ويروس لكه نواري منقوط، ويروس نكروز اكروپتال، ويروس رگبرگ نواري سيب زميني، ويروس لكه نواري و ويروس موزائيك شديد سيب زميني معروف است )15، 26 ،27).

علائم : علائم اين ويروس برحسب سويه و رقم سيب زميني كاملاً متفاوت است. از نظر شدت، از علائم ضعيف تا نكروز برگي شديدو مرگ بوته هاي آلوده فرق ميكند. به طور كلي pvy داراي سه نژادpvyⁿ, pvy^c, pvy^o ميباشد (16،29). شايع ترين آنها نژاد pvyⁿ ميباشد. البته نژاد جديدي در سال 2000 در نواحي آند گزارش شد كه برخلاف ساير نژادهاي كه بر روي سيب زميني باعث بروز لكه موضعي ميشوند هيچ علائمي در آن ايجاد نميكند، ولي روي توتون مثل نژاد n موجب نكروز ميشود (74،7).

به طور كلي  pvy ^oوpvy ^c علائم شديد تري را نسبت به pvyⁿ ايجاد ميكنند. علائم اوليه pvy ^o بسته به رقم سيب زميني شامل نكروز، ماتلي شدن، يا زردي برگچه ها، افتادن برگها و گاهي مرگ زودرس ميباشد.pvy ^c موجب نكروز داخلي و يا خارجي در برخي از ارقام ميشود. pvyⁿ  باعث ايجاد ماتل مبهمي در گياهان با آلودگي در فصل جاري (اوليه)و در گياهان حاصل از غده هاي آلوده

(آلودگي ثانويه) ميشود (26، 30، 75).

مشخصات پيكره ويروس : ويروسY سيب زميني يک پوتي[6]ويروس و از خانواده پوتي ويريده ميباشد که به صورت رشته هاي نخي شكل به طول 730 نانومتر و عرض 11 نانومتر ميباشد. داراي ژنوم RNA ي تك رشته اي ميباشد كه حدود 6% كل پيكره را ژنوم ويروس تشكيل ميدهد وبه صورت ps-ssRNA ميباشد . بقيه پيكره را پوشش پروتئيني به وزن مولكولي 3400 دالتون تشكيل ميدهد، كه شامل 2000 زير واحد است. اين ويروس داراي 9074 نوكلئوتيد ميباشد (65)،كه تنها يكORF[7] با حدود 9000 نوكلئوتيد دارد. ساختار انتهاي^/5 آن vpg و ساختار انتهاي ^/3 آن Capميباشد. پايداري آن در عصاره در دماي 20 درجه سانتي گراد 5 تا 7 روز و پايداري آن در برگ نگهداري شده در دماي 4 درجه سانتيگراد، 15 سال است. دماي بي اثر شدن آن به مدت 10 دقيقه در مورد نژاد O,Cتا 62درجه و براي نژاد N تا 64 درجه سانتي گراد است.

ميزبانها : اين ويروس اكثراً به خانواده سولاناسه حمله ميكند، اما گاهي اوقات به خانواده اسفناجيان و بقولات نيز حمله ميكند. در توتون در بيشتر سويه ها موجب روشن شدن رگبرگ و به دنبال آن ماتلي شدن ميشوند. سويه هاي نكروزي PVY^N باعث ماتلي و برنزي شدن رگبرگهاي اصلي و نكروز برگها ميشود. سويه هايPVY ^O  و PVY ^C در P.florida موجب نکروز موضعي و سيستميک در گياه ميشود. ارقام سيب زميني مانند داک آف يورک براي شناسايي بيشتر نژادهايPVY مورد استفاده قرار ميگيرند.اين گونه ارقام پس از پيوند خوردن با^, PVY ^N, PVY ^O,PVY ^cبه ترتيب ماتلي شدن، موزائيک، رگوز و نوار منقوط را نشان ميدهند.

انتقال : ويروس y سيب زميني به طريقه مکانيکي به راحتي منتقل ميشود. همچنين از طريق غده نيز منتقل ميشود. اين ويروس به وسيله 73 گونه شته منتقل ميشود، که رابطه آن با شته به صورت غير پايا است (15).براي انتقال کافي است که شته 15 دقيقه تا 4 ساعت روي گياه آلوده تغذيه کند و ويروس را کسب کند. در بين شته ها شته سبز هلو معولترين و موئثرترين شته ناقل ويروس است. ساير شته هاي ناقل عبارتند از M.cetus, M.orantus اين ويروس همچنين توسط کنه Letanches نيز منتقل ميشود.

 

2-5-3- pva

اين ويروس به موزائيک خفيف سيب زميني معروف است ودر اکثر مناطق کشت سيب زميني شايع است و ميتواند بازده محصول را 40%کاهش دهد (27،7). اين ويروس اولين بار در سال 1932 معرفي شد .

علائم: علائم روي برگها شامل موزائيک خفيف و پيچيدگي مختصر برگهاي آلوده ميباشد. معمولاً چروکيدگي مختصري در برگها ديده ميشود. بوته هاي آلوده معمولاً باز به نظر ميرسند، زيرا ساقه هايشان به طرف بيرون خميده ميشوند (18) .شدت ظهور علائم بيشتر به شرايط آب و هوايي ،رقم سيب زميني و به نژاد ويروس بستگي دارد. در دماي بالا و در هواي روشن آفتابي، شناسايي علائم مشکل تر از هواي سرد وابري ميباشد. علائم اين بيماري در روي غده ها قابل تشخيص نيست (18).

مشخصات پيکره ويروس: ويروسA سيب زميني يک پوتي ويروس  و از خانواده پوتي ويريده ميباشد. ويروسي رشته اي به ابعاد 15x 730 ميباشد که داراي ژنوم RNA تک رشته اي ميباشد. اين ويروس داراي 9585 نوکلئوتيد ميباشد (65). بيشتر خصوصيات ژنوم و پروتين پوششي آن شبيهPVY ميباشد و تنها از مکانيسم پلي پروتين جهت همانند سازي بهره ميبرد. دماي نهايي بي اثر شدن اين ويروس46 تا 52 درجه سانتي گراد ميباشد. در دماي اتاق 12 تا24 ساعت قدرت آلودگي کنندگي آن دوام دارد.

ميزبانها: ميزبانهاي PVA محدود به خانواده سولاناسه هستند.درتوتون نژادهاي ويروس موجب روشن شدن رگبرگ و ماتل پراکنده ميشوند.در حاليکه درN.itabacum و White Burley روشن شدن و نواري شدن رگبرگ ايجاد ميشود (18). Solanum  demissum .در برابر PVA لکه هاي نکروزي وضعي در برگ يا نکروز سيستميک ساقه به وجود ميآورد. وگياه محک اين ويروس به شمار ميرود.

انتقال:PVA  به وسيله حداقل 7 گونه شته از جمله  شته سبز هلوو شته سيب زميني به طور غير پايا منتقل ميشود.اين بيماري توسط غده ها و به روش مکانيکي با عصاره گياهي و پيوند منتقل ميشود.انتقال با بذر حقيقي و سس گزارش نشده است. (18،6 ،7).

 

2-5-4- PVS

ويروس S سيب زميني تا اوايل سال 1950 ميلادي ناشناخته بود. اين ويروس اولين با توسط اوبوتر در سال 1952 از هلند معرفي شد و امروزه تقريباً در سراسر دنيا، در هر جا که سيب زميني کشت ميشود وجود دارد. ميزان خسارت آن بسته به رقم سيب زميني و نژاد ويروس متفاوت است. اين ويروس علاوه برکاهش مستقيم محصول، اثر تشديد کنندگي بر خسارت ويروسهاي مهم تر مثل PVX , PVY دارد(27). گياهان آلوده غده هاي کوچکي توليد ميکنند و غده هاي آلوده مهمترين منبع انتشار PVS در مزرعه هستند. اين ويروس ابتدا نه از طريق علائم حاصل از آن بلکه از طريق سرم شناسي، در طي تلاشهايي که براي توليد آنتي سرم در مقابل ويروس A سيب زميني صورت گرفت، پيدا شد(7).

علائم: اين ويروس دربسياري از ارقام معمولي سيب زميني بدون علامت است. علائم شامل فرورفتگي جزئي رگبرگها و رگوزي شدن برگها و احتمالاً کم رشدي و تيپ رشدي بازتر ميباشد. بعضي از سويه ها ميتوانندموجب ماتلي يا برنزي شدن در ارقام معيني شوند و يا هنگامي که شديد باشند، ميتوانند لکه هاي نکروزي در سطوح فوقاني ايجاد کنند، در برگهاي مسن تري که در سايه هستند ممکن است به جاي اينکه رنگ زرد يکنواخت به وجود آيد، لکه هاي مايل به سبزي ايجاد شود. آب و هواي ابري علائم را تشديد ميکند.

مشخصات پيکره ويروس: ويروس S سيب زميني يک کارلا ويروس ميباشد که به صورت رشته اي  نخي شکل به طول 650 و عرض 12 نانومتر است. وزن ملکولي پوشش آن 33000 دالتون ميباشد. ژنوم ويروس از rnaي تک رشته اي ميباشد، که داراي 7500 نوکلئوتيد به وزن10⁶x 39/2 دالتون بوده و داراي 2 ساب ژنوم به وزن 10⁶x1 و10⁶x7/0 دالتون ميباشد. ساختار انتهاي ^/5 آن cap و ساختار انتهاي ^/3  آن پلي a بوده و داراي 6 قاب قرائت باز است.

ميزبانها: pvs 20 تا 30 روز پس از تلقيح  روي انواع سلمه تره باعث ايجاد زخمهاي موضعي کلروزه ميشود و در برگهاي پير زرد شده اين لکه ها با هاله سبز احاطه ميشوند. لذا گياهان محک اين ويروس بشمار ميروند. 25 روز بعد از تلقيح روي سيب زميني باعث ايجاد لکه هاي نکروزه سيستميک ميشود.20 روز پس ار تلقيح در توتون برگهاي تلقيح شده علائمي نشان نميدهند. ولي در ساير برگها ، رگبرگها روشن شده و پيسيک و نکروز سيستميک ديده ميشود

انتقال: اين ويروس به راحتي با روش مکانيکي منتقل ميشود. ابزارهاي کشاورزي به خصوص موقع بريدن غده ها براي کاشت، تماس برگها و صدمات مکانيکي در طول مراحل داشت موجب انتقال اين ويروس ميشود. برخي از نژادها با شته سبز هلو و بعضي گونه هاي ديگر شته ها منتقل ميشوند. اين ويروس از طريق بذور حقيقي سيب زمني قابل انتقال نيست و غده ها عامل انتقال ويروس به سال بعد هستند.

2-6- بيو تکنولوژي در سيب زميني

فائو اعتقاد دارد که براي تامين غذاي روز افزون دنيا در بيست و پنج سال آينده، عملکرد محصولات زراعي بايستي به ميزان 60% افزايش پيدا کند، در حاليکه منابع طبيعي و بالطبع منابع غذايي  روز به روز محدود تر ميشوند. به عقيده متخصصان علوم کشاورزي براي حل مشکل تامين غذا و حفظ سلامت محيط زيست، راهکاري به جز فناوري مهندسي ژنتيک و بيو تکنولوژي وجود ندارد. آگاهان علم بيو تکنولوژي معتقدند که گياهان تراريخت ميتوانند توليد غذا را تا 25% در کشورهاي در حال توسعه افزايش دهند و غذاي 3 ميليارد جمعيت اضافي را تامين کنند. بنابراين بيو تکنولوژي تکنيک جديد بشر براي مقابله با مشکلات و معضلات تامين غذا و حفظ محيط زيست در آينده است (69).

يکي از روشهاي بيو تکنولوژي که دردهه اخير مورد استفاده قرار گرفته است متد کشت سلولها و بافتهاي گياهي در محيطهاي مصنوعي ميباشد. سيب زميني اولين محصول عمده خوراکي بود که کاربرد بيو تکنولوژي در آن موفق بوده است. گياهان عاري از بيماري توليد شده در شرايط آزمايشگاهي به مزارع انتقال يافته و درمقياس وسيع در کشورهاي مختلف تکثير گرديده است (8).

 

 

راهنماي جمع‏‏آوري صحرائي نمونه‏هاي ذخاير توارثي گياهي

افزايش توليدات كشاورزي از دو طريق صورت مي‏گيرد. يكي از طريق افزايش سطح كشت كه در نهايت منجر به محدوديت منابع آب و خاك مي‏گردد، دوم از طريق افزايش توليد در واحد سطح كه از طريق اصلاح كمي و كيفي گياهان صورت مي‏گيرد. اصلاح ساختار ژنومي گياهان نياز به مخازن ژني دارد كه اين مخازن در طي قرن‏ها در بستر طبيعت تكامل يافته‏اند. توسعه ارقام اصلاح شده و كشت تك محصولي و عوامل حوادث طبيعي منجر به باريك شدن دامنه تنوع گياهي و آسيب‏پذيري آنها شده است. به دليل آسيب‏پذيري ارقام اصلاح شده لازم است كه ژن‏هاي ساير گياهان زراعي و وحشي به عنوان پشتيبان و ضامن جهت تداوم سازگاري و پايداري ارقام اصلاح شده جمع‏آوري و نگهداري گردند.

برنامه‏هاي زيادي براي جمع‏آوري و انبار كردن منابع ژنتيكي با توجه به الويت‏هاي محصولي و منطقه صورت گرفته است. هدف از جمع‏آوري، با توجه به تنوع گياهي و ژنتيك جامعه، دسترسي به گياهان و ويژگي‏هاي آنها مي‏باشد كه اين ويژگي‏ها در آب و هوا و اقاليم خاص تثبيت شده‏اند. بنابراين بايد روش‏هائي را به كار گرفت كه حداكثر تنوع را با حداقل مواد و هزينه ‏هاي ممكن جمع‏آوري نمود. بطور كلي جمع‏آوري مي‏تواند اهداف متفاوتي داشته باشد. چگونگي جمع‏آوري مي‏تواند با توجه به نوع گياهان ( باغي و زراعي) ، اندام‏هاي مختلف (بذر، غده و ريشه)، تعداد محصول ( يك يا گروهي) و تعداد و شرايط اقليمي و جغرافيائي مناطق (يك يا چند منطقه) به صورت‏هاي مختلف انجام گيرد.

اطلاعات قبلي در مورد جمع‏آوري، پراكنش گياهان و تجربيات گذشته و همچنين بررسي مسير‏ها، نحوه نمونه‏گيري، تكميل پرسشنامة جمع‏آوري، قرنطينه،‌ خشك كردن و گروه‏هاي جمع‏آوري حائز اهميت است.

به منظور برنامه‏ريزي جهت جمع‏آوري، توجه به اطلاعات مربوط به منطقه، محصولات، روش مناسب شامل زمان جمع‏آوري، زمان‏بندي، مسيرها، افراد مجرب، وسايل و تجهيزات كافي ضروري است.

در حال حاضر همه متفق‏القول هستند كه انهدام تنوع ژنتيكي محصولات گياهي در اين چند دهة اخير رو به افزايش بوده و اين نوع فرسايش ژنتيكي در آينده به سرعت ادامه خواهد داشت. كارشناسان اصلاح نباتات نياز مبرم به اين منابع ژنتيكي كه به عنوان اساس پيدايش ارقام پر محصول و اصلاح شده و مقاوم به بيماري‏ها براي كمك به حل مسئله گرسنگي و سوء تغذيه مي‏باشند، دارند.

اخيراً در سراسر جهان كوشش‏هاي زيادي به عمل آمده است و جمع‏آوري، نگهداري و بهره‏برداري از منابع ژنتيكي قبل از فرسايش و انهدام آنها انجام مي‏شود. كارشناسان اصلاح نباتات احتياج مبرم به منابع ژنتيكي محصولات عمدة زراعي و ذخائر ارزنده و گونه‏هاي خويشاوندان وحشي نزديك آنها دارند.

برنامه‏هاي دقيقي براي جمع‏آوري و انبار كردن منابع ژنتيكي و اولويت‏هاي محصولات تهيه و مورد قبول قرار گرفته است. سوء‌ تفاهمات زيادي در بارة روش جمع‏آوري منابع ژنتيكي گياهي وجود دارد. هدف تنها رفتن به صحرا و گرفتن مقداري بذر از يك يا دو بوته و يادداشت‏برداري منطقه‏اي كه در آنجا بذر را پيدا كرده نيست.

دانش ما در مورد طبقه‏بندي گياهي،‌ ژنتيك جامعه و هدف‏هاي اصلاح نباتات زراعي به خوبي نشان مي‏دهد كه منظورهاي جمع‏آوري منابع ژنتيكي كه به نوبة‌ خود يك كار اساسي و منظمي است با جمع‏آوري گياهان به منظور گياهشناسي فرق زيادي دارد. بطور كلي در جمع‏آوري‏هاي بتانيكي گياه‏شناس دنبال يكنواختي و نوع گياه است در صورتي كه جمع‏آوري كننده منابع ژنتيكي دنبال تنوع مي‏باشد و روش‏هائي به كار مي‏برند كه در آن روش‏ها حداكثر تنوع براي حداقل مواد جمع‏آوري شده اعمال مي‏شود.

هنگامي كه براي يك مأموريت جمع‏آوري برنامه‏ريزي مي‏كنيم بايد به خاطر داشته باشيم روش‏هاي خوبي را براي نگهداري به كار ببريم زيرا جمع‏آوري بدون داشتن امكانات نگهداري بي‏فايده است و همچنين بهتر است كه در مراحل اوليه  برنامه‏ريزي موضوع حمل و نقل و قرنطينه را در نظر داشته باشيم. چگونگي جمع‏آ‏وري و مسافرت‏ها با يكديگر فرق نموده و بستگي به طبيعت موادي كه جمع‏آوري خواهند شد و همچنين شرايط آب و هوائي و غيره در منطقه‏اي كه جمع‏آوري انجام مي‏شود و شخصيت و تجربيات گذشته گروه‏هاي جمع‏آوري كننده دارد. آنچه در زير مي‏خوانيد يك سري قوانين غير قابل تغيير نيست بلكه يك سلسله از توصيه‏هاي كلي است كه اميد مي‏رود جمع‏آوري كنندگان از آن پيروي كرده و حتي‏الامكان آن را به كار ببرند و اگر لازم بود تغييرات كوچك در بارة هر محصول داده شود. قسمت‏هاي مهم‏تر شامل تكنيك‏هاي نمونه‏برداري و يادداشت‏برداري كافي و دقيق است تا بتوانيم از اين مدارك و سوابق در بررسي و وضعيت نمونه‏ها استفاده نمائيم.

بطور كلي شرايط و نيازهاي جمع‏آوري منابع ژنتيكي گياهي را مي‏توان به صورت زير خلاصه نمود.

-         جمع‏آوري كننده بايد داراي علم و معلومات خوبي در مورد محصولي كه جمع‏آوري مي‏كند باشد.    

-          جمع‏آوري كننده بايد اطلاعات كاملي در مورد منطقه يا محلي كه بايد به آنجا مسافرت كند داشته باشد.

-          جمع‏آوري كننده بايد سعي كند با به كار بردن روش‏هاي پيشنهاد شده براي نمونه‏برداري از تنوع ژنتيكي هر چه بيشتر استفاده نمايد.

-          جمع‏آوري كننده بايد شناسنامه‏اي مناسب هنگام جمع‏آوري تهيه نمايد.

 

آزمون DAS – ELISA

 

A ( تهیه بافر های مورد نیاز آزمون الیزا:‌

ابتدا بافرهاي لازم جهت الايزا تهیه شدند. چون مواد مورذ نیاز طبق پروتکل براي 1 ليتر در نظر گرفته شده است، در اين آزمايش مقدار مواد بر حسب مقدار بافر مورد نیاز استفاده شده است :‌

 

1-    بافر (1x) PH = 7.4  (Phosphat salin Buffer) PBS

         ml 500                                         ml 1000

Nacl                                             8 gr                                         4gr

KH₂PO₄                                    2/0 gr                                       1/0gr

Na₂HPO₄                                 15/1 gr                                    57/0 gr

KCl                                          2/0 gr                                      1/0 gr

 

 براي تهيه اين بافر، مواد با مقدار فوق  وزن گرديد و در داخل يك بشر ريخته و مقداري آب مقطر به آن اضافه شد. براي حل شدن كامل مواد در آب، ‌يك مگنت در بشر گذاشته و بشر روي دستگاه استرير قرار داده شد تا مواد كاملاً در آب حل شود. سپس pH آن با دستگاه pH-meter  اندازه گيري شد. چنانچه PH محلول مورد نظر بالاتر بود با افزودن HCl و در صورت پایین بودن با NaOH میزان pH تنظيم می شود.

بعد از تنظيم PH با آب حجم محلول به cc 500 رسيد. از اين cc 500 بافر cc 50 آن جهت تهيه بافر Conjugate و cc 50 براي تهيه بافر عصاره گيري (Extraction Buffer) ‌و cc 400 باقيمانده  براي تهيه بافر شستشو (Washing Buffer) استفاده گرديد.

2-    بافر شستشو Washing Buffer PH = 7.4  (PBS –T)

                              ml 400                        ml 1000  

                              0.5 ml                        200 μl                  Tween 20

 براي تهيه اين بافر مقدار گفته شده از  Tween 20 در همان مقدار از بافر PBS كه در بالا گفته شده حل شد. ابتدا بايد pH بافر روی 7.4 تنظیم شده و سپس حجم بافر با افزودن آب به cc 400 رسید.

 

3-    بافر عصاره گيري (Extraction Buffer) PH = 7.4

تركيبات زير با نمك هاي مورد نياز جهت تهيه بافر PBS ادغام شد. و پس از تنظيم pH محلول همانند مراحل قبل كل حجم محلول به cc 50 رسيد.

                             cc 50                            ml 1000

                             gr 1                             gr 20                        PVP MW 24000

                             μl 200                         ml 5/0                     Tween 20

 

4-    بافر پوشش دهنده PH = 9.6  (Coating Buffer)

                          cc 50                     ml 1000 

                         gr 07/0                  gr 59/1                      Na₂Co₃

                        gr 15/0                  gr  93/2                  NaHCo₃  

                        gr 2%                    gr   2/0                         NaN₃   

 همانند مراحل  قبل  مواد گفته شده وزن شد و پس از تنظيم PH به حجم cc 50 رسيد.

 

5-    بافر تركيب پادتن – آنزيم (Conjugate Buffer)   PH = 7.4

                            cc 50                  ml 1000

                           gr 1                   gr  20                PVP MW 24000  

                         μl 20                     ml 5/0                  Tween 20

                         gr  1/0                  gr 2                      egg albumine 0.2%    

نمك هاي بالا به بافر PBS اضافه شد و پس از همزدن و تنظيم pH حجم آنها به cc 50 رسيد.

 

6-    بافر سوبسترا  PH = 9.8  (Substrate Buffer) 

                             ml 20                    ml 1000

                            ml 944/1                   ml 97              diethanolamine

تنظيم براي اسيديته از طريق اسيد هيدروكلريك (HCL) صورت مي پذيرد.

واکنش ژنوتیپ های گندم به تنش گرمایی در مرحله گذر از رشد رویشی به رشد زایشی

کاشت ارقام سازگار و متحمل به گرما موثرترین راه مقابله با تنش گرما در مناطق گرمسیری از جمله ایران می باشد. مرحله گذر از رشد رویشی به رشد زایشی (مرحله برجستگي دوگانه مريستم)یکی از مهمترین مراحل رشد و نمو گیاه گندم می باشد که ظرفیت عملکرد آن در این مرحله تعیین می شود. بنابراین ارزیابی واکنش در ژرم پلاسم گندم به تنش در این مرحله حساس برای اصلاح ارقام متحمل به گرما حائز اهمیت است. اثرات تنش گرما در مرحله برجستگی دوگانه بافت مریستم ساقه در 5 ژنوتیپ از ژرم پلاسم گندم بانک ژن گیاهی ملی ایران در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی و گلخانه ارزیابی شد. ارزیابی تحمل به تنش گرما به دو روش افزایش تدریجی گرما تا C° 40 در گلخانه(به مدت 20 روز) و اعمال تنش گرمای C°35(به مدت 5 روز) در اتاقک رشد صورت گرفت. تنش تدریجی گرمای C°40 موجب نسريع در تشكيل مريستم هاي سنبلچه و گلچه ژنوتیپ هاي اترک و KC-4512 شد و بر روي ژنوتیپهاي KC-7033, KC-7168, KC-4511 تاثیری نداشت درحاليكه اين تنش بر روي تعداد مريستم هاي سنبلچه در هيچيك از ژنوتيپ هاي مورد بررسي معني دار نشد. واكنش ژنوتيپ هاي گندم به شوك گرماي C° 35 در مرحله برجستگي دوگانه از نظر صفات اجزاي عملكرد دانه به طور معني داري متفاوت بود. مشاهده تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپ ها از نظر حساسیت به تنش گرما در مرحله برجستگی دوگانه مریستم، نشان می دهد که می توان از ایجاد تنش گرما در این مرحله به عنوان روشی بسیار سریع، جهت غربال اولیه ژنوتیپ های متحمل به گرما استفاده نمود.

استخراج DNA از گياه و قارچ

 

 

  

  را مطابق دستور زير تهيه مي كنيم:

TESS 1- اول بافر

A: Tris NaoH( or HCl )………..100 mM

B: EDTA………………………..1mM

C: NaCl…………………………50mM

D: SDS…………………………2%

 

2- حدود 3 گرم بافت برگ گياه در ازت مايع با هاون خرد شود.

 

3- مقداري از بافت خرد شده (حدود 2/0 گرم ) را داخل تيوب 5/1 سي سي ريخته و به آن ( 1/0 تا 3/0 حجم تيوب ) اضافه مي كنيم.  TESS  500  ميكروليتر بافر استخراج

 

4- به مدت 10 دقيقه در دماي اتاق روي شيكر به هم بخورد.

 

5- بعد از هم خوردن به مدت 10 دقيقه به آن 150 ميكروليتر استات پتاسيم 5 مولار اضافه مي كنيم و دوباره روي شيكر به مدت 5 دقيقه قرار مي دهيم (در دماي اتاق).

 

6- بعد از به هم خوردن سانتريفيو‍‍‍ژ تيوبها به مدت 4 دقيقه و با سرعت 7000 دور انجام مي گيرد.

 7- بعد از سانتريفيوژ، فاز رويي تيوپ را به تيوپ جديد منتقل كرده و رسوب بافت گياهي را از آن حذف مي كنيم.

8- به فاز رويي سانتريفيوژ در تيوپ جديد، هم اندازه حجم خود آن الكل 96% اضافه كرده و به آرام چند بار به هم زده تا باهم مخلوط شده و بعد به مدت 20 دقيقه در فريزر 20- قرار  مي دهيم.

9- در مرحله بعد، از فريزر بيرون آورده و سانتريفيوژ دوم  آنرا با 14000 دور و مدت 6 دقيقه انجام مي دهيم.

 در ته تيوپ را باDNA10- بعد از اتمام سانتريفيوژ فاز رويي را سريعا" خالي كرده و پليت  اتانول 70% شستشو مي دهيم ( هر بار با 100 ميكرو ليتر).

 

11- بعد از شستشو سر تيوبها را به مدت نيم ساعت باز گذاشته تا خشك شوند و بعد به هر  يا آب مقطر اضافه مي كنيم.TE كدام از آنها 100 ميكروليتر بافر