بيماري بلايت باكتريايي پنبه Xanthomonas axonopodis pv malvacearum

                                  فروغ گنجعلی

بيماري بلايت باكتريايي پنبه Xanthomonas axonopodis pv malvacearum يكي از مهمترين عوامل خسارتزاي پنبه مي باشد و تقريباً در تمامي مناطق پنبه كاري دنيا وجود دارد . اين بيماري در ايران براي اولين بار در سال 1338 توسط دفتري از طالخونچه اصفهان گزارش شد . با توجه به قرنطينه اي بودن عامل بيماري و مشاهده علائم بيماري در سال 1383 در يكي از مزارع شهرستان گرمسار رديابي عامل بيماري از روي بذور وارد شده به شهرستان و همچنين رديابي جهت مشاهده علائم بيماري در مزارع از ارديبهشت 1384 آغاز شد . در رديابي مزارع كه در 5 روستا به طور تصادفي انجام شد علائم بيماري در هيچيك از مزارع مشاهده نشد و در رديابي بذور كه به روي سه رقم تجاري ورامين ، بومي و ساحل به 4 طريق مختلف انجام شد نيز عامل بيماري جداسازي نشد . 

استخراج DNAي ژنومي

براي استخراج DNA از بافتهاي برگي استفاده گرديد. بذور هر يك از توده‌ها در گلدان كاشته شده و 20 روز پس از كاشت، 5 بوته از هر توده انتخاب گرديده و برگهاي هر بوته بطور جداگانه چيده شده و در داخل ورقه. آلومينيومي پيچيده و بر روي يخ گذاشته و بلافاصله به آزمايشگاه منتقل مي‌شد. مقدار 20 ميلي‌گرم از برگ بوته‌هاي انتخابي مربوط به هر توده را وزن نموده و سپس برگهاي 5 بوته با هم مخلوط مي‌شد و براي استخراج DNA مورد استفاده قرار مي‌گرفت (60، 107). استخراج DNA با استفاده از CTAB [1] و بر اساس روشي كه توسط سقائي معروف و همكاران در سال 1984 ارائه شده صورت گرفت (121). البته محلول‌هاي مورد نياز اين روش استخراج به شرح زير آماده شد:

الف – بافر استخراج [2] : براي تهية cc100 محلول بافر مواد زير مورد نياز است.

%2 M4/1 0/8 = pH و M1/0 mM20 0/8 = pH و %2/0

CTAB -1 NaCl -2 Tris-HCl – 3 [3] EDTA – 4 β-mercaptoetchanol - 5

 

مواد بالا را در داخل آب دوبار تقطير حل نموده و حجم نهايي را به cc100 مي‌رسانيم. قبل از استفاده، محلول توسط اتوكلاو استريل مي‌گرديد.

---

[1] - Cethyle Trimethyle Amonium Bromide

[2] - Extraction buffer

[3] - Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

مهمترين بيماريهاي برنج در گیلان

از مهمترين  بيماريهاي  برنج  ، به بلاست  برنج     ( Blast )  میباشد  كه معمولا“ بعلت  انتشار  وسيع  و تاثير  مخربش  در  شرايط  مناسب  ، بيماري  اصلي  برنج  بشمار  مي آيد  كه به  عملكرد  محصول  خسارت  قابل  توجهي  وارد  مي سازد .علايم  اوليه  بيماري  بلاست  بستگي  به  شرايط  اقليمي دارد  . در نواحي  معتدل  كه دوران  بارانهاي ريز و يا  بارندگي  خفيف  طولاني  مي باشد  ، بلاست  برنج  در مرحله  پنجه زدن  شديد  بوده  و اغلب  بوته ها  مي ميرند .بررسيهاي  اوليه  انجام  شده  در اداره  تحقيقات  هواشناسي  كشاورزي  رشت  گوياي  اين مطلب  مي باشد  كه چنانچه  5 روز  متوالي  رطوبت  نسبي  هوا  از  70% بيشتر  و دما بين  25  تا  35  درجه  سانتيگراد  و ابرناكي  بيشتر  از  8/6 باشد ، شرايط  مساعدي  براي  طغيان  اين بيماري  فراهم  ميگردد .بهترين  متد مبارزه  با  اين  بيماري  ايجاد  سيستم  پيش آگاهي  است  كه نقش  ادارات  تحقيقات  هواشناسي  كشور  در مناطق  كشت  اين محصول  در اين  سيستم  كاملا“ شاخص  است .

ساير  بيماريهاي  برنج  شامل  : لك  قهوه اي  برنج  ، بيماري  پوسيدگي  طوقه  ، بيماري  سوختگي  غلاف  برگ ، بيماري  پوسيدگي  ساقه  ، سياهك برنج  در  درجات  بعدي  اهميت  مي باشند .

چند بیماری سیب زمینی

سمیرا فوجردی

ساق سیاه

باعث پوسیدگی نرم می شود این باکتری داخل یا روی بذر وجود دارد که وقتی بذر کاشته می شود

قطعات بذر متلاشی می شوند و این باکتری ها به درون خاک منتشر می شوند و گاهی ساقه

گیاه میزبان را آلوده می کنند این باکتریها در غده ها یا ساقه های آلوده در زمستان زنده می مانند

و در خاک برای یک زمان کوتاه باقی می مانند بقای آنها در شرایط مرطوب نسبت به گرما

طولانی تر است این باکتری ها در ابی که برای شستشوی بذرها استفاده می شود گسترش می یابند

آلودگی بذرها توسط Erwiniaتوسط رطوبت خاک ودر درجه حرارت های پایین افزایش می یابد

ممکن است٨٠-١١٠ روز در دمای˚ ٢زنده بمانند درجه حرارت های خاک روی تجزیه بذر

تاثیر می گذارد و باعث مرگ زودرس شاخه ها می شوند.درجه حرارت خاک روی تجزیه بذر اثر می گذارد

وباعث مرگ زودرس شاخه ها می شود.تعدادی از گونه های حشرات باکتری ها را از کرک های سلولی سیب زمینی

 یا گیاهان آلوده بسوی قطعات بذر یا روی ساقه های سالم در حال رشد منتشر می کنند.

کنترل

عدم آبیاری بیش از حد برای پیشگیری شرایط بی هوازی

کندن بوته های وازده سیب زمینی و دور ریختن سبزیجات و...

پوسیدگی قهوه ای

به عنوان پوسیدگی باکتریایی جنوبی شناخته شده است .این بیماری رشد محصولات سیب زمینی و سایر

محصولات مستعد دربخش هایی از آسیا ٬آفریقا٬جنوب و بخش های  مرکزی قاره آریکا را محدود می کند.

علائم

رشد کم ٬زرد شدن وپوسیدگی برگ .پوسیدگی و متلاشی شدن ساقه ها شاید در گیاهان جوان و شاداب که قابلیت

بیماری در انها بیشتر است شدیدتر باشد.در ساقه سیب زمینی های جوان نوارهای باریک تیره مربوط به مجراهای

آوندی الوده می باشند که از میان اپیدرم نمایان می شوند پوسیدگی قهو ای وپوسیدگی  حلقوی علائم مشابه اما قابل

تشخیص دارند.یک مشخصه ارزشمند از پوسیدگی قهوه ای دانه های براق خاکستری تا قهوه ای رنگ شیره لزج

روی آوندهای چوبی آلوده درد برش های عرضی ساقه می باشند.

چشم صورتی

چشم صورتی در غده های گیاهان آلوده به پوسیدگی ناشی از آفت Verticillium به وفور دیده می شود.

علائم

نواحی صورتی در اطراف چشم ها تدریجا به رنگ قهوه ای در می آید نواحی رنگ پریده به ویژه در نوک غده

فراوان هستند که به درون غده گسترش می یا بند.

شانكر درختان ميوه هسته دار

                                       زينت اكاتي

عامل بيماري شانكر يا گموز درختان ميوه ي هسته دار،باكتري Pesudomonas syringae pv. syringae  است . اين باكتري ميله اي شكل به طول 5/2 و به قطر7/0ميكرومتر مي باشدكه داراي يك تاژك قطبي است . باكتري به صورت انفرادي يا جفت و ندرتا" زنجيره اي كوتاه ديده مي شود . باكتري هوازي بوده ،توليد كپسول مي نمايد . در محيط كشت ، باكتري فلورسنت سبز توليد مي كند . اين باكتري داراي چندين نژاد با قدرت بيماريزايي مختلف در گياهان است .

علائم بيماري

مهمترين علائم به صورت شانكرو توليد صمغ در شاخه هاي الوده است . نواحي الوده كمي فرو رفته و تيره تر از بخشهاي  سالم بوده ، اغلب به طرف بالا پيشروي مي كنند . توسعه ي بيماري به سمت پايين ندرتا" ديده مي شود . توليد صمغ در اطراف نواحي الوده بعد از خواب زمستاني شروع مي شود . صمغها از پوست خارج و به سمت پايين سرازير مي شوند . زخمهايي كه صمغ در انها تشكيل نمي شود نرم ، فرو رفته و مرطوب تر بوده ، ممكن است بوي ترشي نيز بدهند . چنانچه بيماري دور تا دور يك شاخه را فرا گيرد ظرف يك هفته بخش هوايي بالاي ان منطقه به كلي خشك مي شود . بيماري به شكوفه ها و برگها نيز سرايت مي كند و در شرايط  جوي مساعد ضمن خشك كردن شكوفه ها و شاخه هاي گل دهنده موجب مرگ سريع شاخه ها نيز مي گردد .

روي برگها ممكن است لكه هاي نكروتيك مثلثي يا مدور به قطر 1تا3 ميلي متر ظاهر شوند .  لكه ها پس از مدتي حالت غربالي پيدا مي كنند . در روي ميوه ها نيز ممكن است لكه هايي به قطر 2تا 10 و به عمق 2تا 3 ميلي متر تشكيل شوند .رنگ لكه ها قهوه اي تيره تا سياه و گاهي قرمز مي باشند . لكه ها خصوصا" در گيلاس ممكن است قهوهاي شده صمغ ترشح نمايند.

مبارزه

مبارزه با اين بيماري مشكل است. اقدامات زراعي از قبيل انتخاب پا يه و پيوندك سالم و مقاوم همراه با مبارزة شيميايي مؤثر مي باشند. براي مبارذه شيميايي از محلول بردو 10،15،100 در پاييز و به نسبت 6 درهزار  در بهار قبل از شكوفه دهي استفاده مي شود. استفاده از آنتي بيوتيك استرپتومايسين در بهار براي كاهش لكه برگي تأثير بيشتري در مقايسه با محلول بردو داشته است. ولي استفاده از انتي بيوتيك به لحاظ دارا بودن اثرهاي منفي در محيط زيست توصيه نمي شود.

 

 

بیماری مهم باکتریایی گرگان

                                           شيلا شيرين بيك مهاجر

 محل سكونت: گرگان

 مهمترين بيماري باكتريايي محل سكونت: لهيدگي ساقه ذرت   bacterial stalk rot

 عامل بيماري: Dickeya chrysanthemi

 مناطق انتشار: استراليا ،هندوستان،مكزيك،فلسطين،آفريقاي جنوبي،مصر،ايران وآمريكا

 علائم:  - نرم شدن ميان گره هاي پاييني در قسمت پايه گياه

          - پژمرده شدن گياهان

          - گياهان پژمرده ممكن است بوي ترشيدگي و تخمير بدهند.

          - خوشه ها ممكن است نرم و پوسيده شوند.

         مبارزه: در آمريكا آب كلردار به غلظت 1ppm با سيستم آبياري باراني از گسترش و پخش بيماري بطور قابل ملاحظه اي مي كاهد.

در هندوستان مقاومت در يك رقم محلي آزاد گرده افشان به نام CM600 مشاهده شده است.

 منابع:

          - كتاب راهنماي آفات و بيماريهاي ذرت در ايران و جهان      تاليف:محمد جواد هيرهادي

          - كتاب آفات و بيماريهاي مهم ذرت در ايران                      تاليف: وزارت جهاد كشاورزي  

کاربرد باکتری ها در کنترل زیستی نماتدها "

ماریا زیادلو

 باکتری ها در همه جا موجودند و تقریباٌ به خاطر پایداریشان در رایزوسفردر تمام خاک ها به

 نماتد ها آسیب می رسانند. باکتری هایی مثل     pasteuria  penetranنماتدها را بارفتار

 انگلی اش ازبین می برد.درحالیکه رایزوباکترهای غیر پارازیت جمعیت نماتدها را باتجمع در

 رایزوسفر گیاه میزبان کاهش می دهند.

 تعدادی از رایزوباکترهایی که به عنوان کاهش دهنده ی جمعیت نماتدها شناخته شده اند شامل :

 Bacillus ,Agrobacterium,Pseudomonas,Streptomyce,Desulfovibrio,…..

 که کاربرد برخی از این باکتریها نتایج امیدبخشی بدست داده است.

 باکتریهای بکاررفته درکنترل زیستی نماتدها به 2 گروه تقسیم می شوند:

 

1- باکتری های پارازیت    2- رایزوباکترهای غیر پارازیت

 از گروه اول Pasteuria  penetrans به طور وسیع به عنوان پارازیت نماتدهابررسی شده

 است.اما باکتری های دیگری ازقبیل    denitrificens   Pseudomonas­­­­­به عنوان پارازیت

  Xiphinema  Americans شناخته شده است.ازبین ایندوباکتری P.penetrans درمبارزه

 زیستی به خصوص علیه گونه های  meloidognاز رایزوباکترهای غیر پارازیت که روی

 نماتد اثر کاهشی دارند از قبیلAgrobacteriumکه به خصوص پس از ترکیب شدن با مواد

 آلی وواردشدن به خاک یا تحت شرایط غیرهوازی خاصیت کاهش دهندگی شان افزایش می

 یابد. البته مطالعات زیادی که در زمینه ی توانایی باکتری ها در کنترل زیستی نماتدها شده است

 محدود به گلخانه و گلدان می باشد وسعی بر این است که تجربیات حاصل به شرایط مزرعه

 منتقل شود.

بیماری های باکتریایی انگور

                                                                فرزانه آزادی

کلمات کلیدی :انگور, Xanthomonas ampelina Agrobacterium tumefaciens  و Xylella fastidiosaو Flovescence doree_گال گوشتی لکه برگی, شانکروبلایت .

عامل بیماری گال طوقه Agrobacterium tumefaciensمربوط به خانواده Rhizobiaceaeگرم منفی ومیله شکل است که علائمی که ایجاد می کند گال گوشتی ورشد کالوسهای گوشتی است که در نزدیکی منطقه زخمی درخت ظاهر  می شود گالها در پاییز به صورت چوب پنبه ای در می آیند. سیکل بیماری به این صورت است که در هنگام بهار در زمان صمغ ریزی باکتری از ریشه به سمت بخش های بالایی حرکت می کند.باکتری در شیره انگور, کالوس ریشه وقلمه های ریشه دار شده موجود است. برای کنترل از ایزوله های K84که یک آنتی بیوتیک تولید می کننداستفاده می کنند که برخی ایزوله های پاتوژن را مهار می کند, اما روی biovar3اثر ندارد. مواد شیمیایی مثل Kereson برای مبارزه به کاربرده شده است.

عامل بیماری بلایت باکتریایی Xanthomonas ampelinaازجنس Xanthomonasگرم منفی ومیله ای با یک تاژک علایمی که ایجاد میکندلکه برگی وشانکر وبلایت است بازشدن سیخک با تاخیر انجام می شود جوانه ها ضعیف,زرد باخطوط قهوه ای تبره که بریک طرف ایجاد میشوددر برگ نکروز حاشیه ای ظاهر می شود.سیکل بیماری به این صورت استکه باکتری در آوند وقلمه ها زنده می مانند وبه صورت آوندی به سمت شاخه های سالم حرکت می کنند .به وسیله ابزار هرس وباران وزخم ایجادشده توسط فریزشدن به گیاه واردمیشود. برای کنترل باید ازابزارهایی برای پیوندو کاشت استفاده شودکه بدون آلودگی باشد ,شاخه های آلوده باید هرس یا سوزانده شوند,اسپری بامحلول برداکس وترکیبات مسی توصیه شده است.

عامل بیماری پیرس Xylella fastidiosaگرم منفی بادیواره سلولی حلقوی .علائمی که ایجادمیکندبه این صورت است  پژمردگی ولکه برگی در نزدیکی حاشیه برگ یا تمام برگ ایجاد می شود  وبرگ ها از نزدیکی دمبرگ می افتند .جوانه ها به صورت کند رشد می کنند میان گره ها جوانه ها کوتاه می شود. سیکل بیماری به این صورت است که عامل این بیماری توسط زنجره های Cicadellidae)و(Cercopidae) منتقل می شوندمایعی که ازبدن آنها دفع می شود باعث انتقال آلودگی می شود. برای کنترل از کالتیوارهای مقاوم استفاده می کنندقراردادن قلمه های انگور دراب 45 درجه سانتی گراد مدت 3ساعت بیماری رااز بین می برد .درما ن شیمیایی واستفاده و از حشره کش وقرنطینه موثر نیست.

عامل بیماری زردی انگور Flovescence doreeعلایم آن به این صورت است که از رشدانگور چلوگیری می کند وبازشدن غنچه ها رابه تاخیر می اندازدمیان گره ها کوتاه می شوند وجوانه ها به صورت مارپیچ در می آیند ,لکه برگی های خامه ای رنگ ایجاد می شود که نکروز می شود.دانه ها هم چروک می شوتد.سیکل بیماری به این صورت است که توسطزنجره منتقل شود تخم را در آوند چوبی وقسمت های چوبی انگور می گذارند پاتوژن در زمستان در فاز نهفتگی است ودر بهار توسط S.littolaris از گیاه مکیده می شود وبعد از 3_4هفته حشره آلوده است .برای کنترل باید انگوررادر شرایط قرنطینه قرار دهیم ویاروش آب گرم می تواند بیماری را محدود کند .می توان از ارقام مقاوم استفاده کرد .استفاده از اسپری Oleoparathinمفید است .

علائمی که Bois Noir andVergilbungskrankheitایجاد میکند شبیه Flovescence doreeاست ولی از3جهت باهم فرق دارند اولی کالتیوارها به یکی حساس وبه دیگری حساس نیست.زنجره ناقل Flovescence doreeرا منتقل می کندولی Bois Noir Vergilbungskrankheiرا منتقل نمی کند اپیدمولوژی بیماری ها باهم فرق می کند.

 

 

 

 

پژمردگي باكتريايي سيب زميني

عالمه دوست محمديان

 

اين بيماري انتشار جهاني دارد و اولين بار در سال 1896 در آمريكا گزارش شد.علاوه بر سيب زميني قادر است به گوجه فرنگي، فلفل ، بادمجان نيز حمله كند ، نژاد هاي ديگر اين باكتري در موز و توتون نيز به صورت پاتوژن عمل مي كنند. در ايران فقط سيب زميني به اين عامل مبتلا ميشود. در دشت بروجن سبب پژمردگي و مرگ 56% بوته ها و37%محصول گرديد.و در حال گزارش از گلستان مي باشد.

عامل بيماري

باكتري Ralstonia solanacearum عامل بيماري  پژ مردگي  باكتريايي در سيب زميني مي باشد. باكتري از نوع ميله اي كوتاه ،گرم منفي و داراي يك تاژك قطبي است.باكتري در غده سيب زميني ،علفهاي  هرز خانواده سولاناسه وخاك زمستان گذراني ميكند.غالبا از طريق زخم ناشي از ادوات كشاورزي و نماتد ها  وارد مي شود و از طريق نشا آلوده گوجه ،فلفل وبادمجان و غيره  انتشار مي يابد.

علايم بيماري

علايم بيماري به صورت پژمردگي در تمام مراحل رشد بوته ظاهر ميشود.اندامهاي هوايي بوته سيب زميني مبتلا ،پژمرده و پلاسيده شده،برگها سبز خشك ميشوند.ممكن است آلودگي بوته ديده شود،در حالي كه هيچ علايمي در غده ها ظاهر نگردد،عكس آن هم ممكن است مثلا اندامهاي بوته هيچگونه علايم نشان ندهند ولي در غده آثار بيماري به صورت سياه شدن آوند ها ديده شود. چنانچه غده هاي آلوده برش داده شوند ترشحات باكتريايي به صورت قطرات سفيد رنگي از آوندها خارج مي گردد.    

چنانچه بيماري شدت يابد زير پوست غده هاي سيب زميني لكه هاي فرو رفته تيره رنگ ايجاد مي شوند. اغلب در ناحيه چشمها و انتهاي غده مواد چسبنده اي خارج مي شود كه باعث چسبيده شدن ذرات خاك به صورت قشري نازك در محل آلودگي مي گردد.

مبارزه

كاشت غده هاي سالم و عاري از آلودگي، استفاده از واريته هاي مقاوم،تناوب 5ساله،دفع علف هاي هرز و مبارزه بيولوژيك با استفاده از ايزوله هاي Bacillus spp   جدا شده از ريزوسفر گياهان مختلف،در كنترل بيماري پژمردگي باكتريايي سيب زميني مؤثرند.

 

باكتريهاي حل كننده فسفات و نقش انها در افزايش رشد گياه

                                                                          خجسته مهدويان

شمار قابل توجهي از گونه هاي باكتريها قادرند تاثير مثبتي بر روي رشد گياهان بگذارند كه از انها به "PGPR " يا رايزوباكترهاي افزايش دهنده رشد گياه نام برده شده است. مانند استرين هايي از باكتري هاي Peudomonas ، Bacillus  و Rhizobium و . . . .   .

تلقيح اين باكتريها در ازمايشگاه و ازمايشات مزرعه اي ثابت كرده است كه سبب افزايش محصول در برخي گياهان مي شوند. بنابراين از اين باكتريها به عنوان كود زيستي يا عوامل كنترل در محصولات مختلف بكار برده مي شود.

يك مكانيزم عمل اين باكتريها در افزايش رشد گياه حل كردن فسفاتهاي غيرالي و معدني كردن فسفاتهاي الي است كه موجب توليد فسفر قابل دسترس گياه مي شود. مكانيسم اصلي حل كردن فسفات معدني توليد اسيدهاي الي مي باشد.

مطالعات در مورد اين باكتريها نشان داده است كه تلقيح استرين هاي اين باكتريها بطور همزمان، تلقيح گروهي باكتريهاي حل كننده فسفات با ميكروارگانيسم هاي ديگر مانند Azotobacter ، تلقيح باكتريهاي حل كننده فسفات بهمراه VAM  ( Vesicular Arbuscular Mycorrhiza ) و همچنين استفاده از كودهاي زنده تجاري مي توانند هر يك باعث تامين همزمان P و N ودر نتيجه افزايش رشد و بازده محصول شوند.

 

 

مراحل انجام آزمون الایزا

 

1) ‌پوشش دادن كف چاهك هاي اليزا با IgG :‌

 براي اينكه كف چاهك را با IgG پوشش دهيم نياز است ابتدا IgG را رقيق كنيم براي اينكار از بافر كربنات (Coating Buffer) استفاده شد.

IgG به نسبت 500 / 1  رقيق شد يعني μl 10 از IgG را به cc 10 بافر كربنات اضافه كرديم و كاملاً بهم زديم. بعد از اين كار مقدار μl 100 از IgG محلول در بافر پوششي را به هر چاهك اضافه كرده و بعد از اينكه تمام چاهك ها پر شد روي پليت با يك پارافيلم پوشانيده شد. پوشانيدن پليت با پارافيلم براي اين است كه IgG تبخير نشود. سپس پليت اليزا در يخچال كه دماي آن C ˚ 4 سانتيگراد بود به مدت يك شب ماند اين كار به منظور اتصال بهتر IgG به كف چاهك انجام شد.

 

4) شستشوی چاهک ها با بافر شستشو:

بعد از اينكه IgG در چاهك ها به مدت يك شبانه روز ماند پليت اليزا را از يخچال خارج كرده و با سمپلر IgG اضافي را از چاهك ها خارج كرده و در داخل ظرفي كه مخصوص آنتي بادي است برگردانده شد. در اين مرحله باید دقت شود تا نوك سمپلر به كف چاهك ها برخورد نكند. (در صورت برخورد، IgG متصل شده به كف چاهك كنده شده و همراه با بقيه IgG هاي اضافی خارج مي شود)

چاهك ها را 3 بار و هر بار به مدت 5 دقيقه با بافر شستشو مي شوييم. براي اين كار بافر را با فشار كم وارد چاهك ها كرده تا IgG كف چاهك كنده نشود.

 

2) تهيه عصاره گياهی و افزودن آنتي ژن به چاهك ها ‌:

 براي تهيه عصاره گياه،‌ برگهايي را که قبلاً به آنها مشكوك هستيم و حاوي ويروس مورد نظر است را به قطعات ريز تكه تكه كرده و رگبرگ اصلي همراه با ساقه ها و دمبرگ ها جدا شده و فقط از پهنك برگ استفاده شد. سپس قطعات برگ درون هاون چيني ريخته شده و بافر عصاره گيري به نسبت 1 گرم از بافت برگ به cc1 بافر اضافه گرديد و با دسته هاون برگها  كاملاً خرد شده بطوريكه عصاره سبز گياه كاملاً خارج شد. سپس عصاره مخلوط با بافر استخراج در داخل تيوپ هايي كه قبلاً شماره گذاري شده بود ريخته شد. لازم به ذكر است كه كليه مراحل استخراج عصاره در هاون برروي یخ انجام شد و تيوپ هاي اپندورف بعد از پر كردن با عصاره در داخل يخ قرار داده شدند تا فعاليت آنزيم ها به حداقل كاهش يابد.

سپس μl 95 از هر عصاره داخل تيوپ را كشيده و به درون چاك ها ریخته شد. لازم است قبل از اين كار نقشه پليتي را كه مي خواهيم عصاره درون آن ريخته شود بكشيم و محل هر نمونه مشخص شود. به درون چاهک های حاشیه ای عصاره نمونه ریخته نمی شود و به جای آن با آب مقطر پر می شوند. علت اينكه فقط در چاهك هاي حاشيه اي آب مقطر ریخته می شود، ‌جلوگيري و حذف اثر زمينه اي (Back ground) است.

به غير از نمونه هاي مورد بررسي 2 چاهك را با عصاره نمونه سالم (شاهد منفي) و 2 چاهك با عصاره آلوده (شاهد مثبت) و دو چاهك نيز فقط با بافر عصاره گيري به عنوان بلانك پر گرديد.

 مجدداً  روي پليت با پارافيلم پوشانيده شده و جهت Over night به مدت 1 شب در يخچال در دماي  ˚c4 قرار داده شد.

 

5) شستشوی چاهک ها با بافر شستشو:

پس از ریختن عصاره گیاهی از درون چاهک های پلیت، چاهك ها را مانند مرحله قبل  3 بار و هر بار به مدت 5 دقيقه با بافر شستشو مي شوييم. براي اين كار بافر را با فشار كم وارد چاهك ها كرده تا IgG كف چاهك كنده نشود.

 

6) افزودن آنتي بادي متصل شده به آنزيم (IgG^_Conjugate)‌

IgG Conjugate همان IgG است كه در ستون كروماتوگرافي خالص شده و با گلوتار آلدئيد به آنزيم آلكالين فسفاتاز متصل شده است. بعد از اينكه عصاره ها را از داخل چاهك ها خارج كرديم 3 بار شستشو انجام داده شد. وبعد IgG Conjugate  به چاهك ها اضافه شد. قبل از اضافه كردن IgG Conjugate  آنرا به نسبت 500 / 1 رقيق کردیم. براي رقيق كردن مقدار   μl 2 از  IgG Conjugate  به cc 1 بافر Conjugate  باید اضافه شود و مقدار μl 90 از اين ترکیب را به هر چاهک اضافه می شود. پس از پر كردن همه چاهك های درونی (چاهک های حاشیه ای با آب مقطر پر می شوند) سطح پليت با پارافيلم پوشانيده شد و در داخل انكوباتور به مدت 4 ساعت در دماي 37 درجه سانتيگراد قرار گرفت.

 

6- اضافه کردن سوبسترا :

 بعد از 4 ساعت پليت اليزا را از انكوباتور خارج كرده و با سمپلر IgG Conjugate اضافي از چاهك ها كشيده و به ظرف مخصوص آن برگردانيده شد.  سپس همانند مراحل قبل چاهك ها را شستشو داده و در مرحله بعد سوبسترا به چاهك ها اضافه گرديد. براي اضافه كردن سوبسترا لازم است تا قرص آنرا در بافر سوبسترايي كه تهيه كرده ايم حل كنيم (سوبسترا را كه بصورت قرص پارانيترو فنيل فسفات  است بايد به نسبت mg / ml 1  در بافر سوبسترا حل كنيم).

    بنابراين        μl 9600 = μl   100   ×  96

مقدار مورد نياز سوبسترا براي كل پليت 96 خانه اي → ml 6/9 = μl 9600 → μl 1000 = cc 1

 يعني در مجموع 6/9 ميلي لیتر از تركيب فوق را نياز داريم تا به 96 خانه اضافه كنيم چون نسبت قرص  mg 1 در ml 1 از بافر است پس 9 ميلي گرم آنرا در cc 10 بافر بايد حل كنيم.

 پس از تهيه تركيب سوبسترا در محلول  بافر سوبسترا به ميزانμl  87  از بافر را كشيده و به چاهك اضافه مي كنيم. و به منظور جلوگیري از تاثير نور برروي سوبسترا پليت را در محل تاريكي قرار می دهیم. اگر حداكثر تا 2 ساعت پس افزودن محلول سوبسترا واکنش رنگ زایی در چاهك ها مشاهده نشد بايد پليت را  درون يخچال با درجه 4 به مدت 24 ساعت قرار دهيم. پس از واکنش رنگ زایی می توان به منظور توقف واكنش رنگ زايي به هر چاهك مقدار 10 ميكرو ليتر از محلول سود 3 مولار اضافه كنيم.

 در نهايت نتايج را يادداشت مي كنيم  و نتايج را با نقشه اي كه قبلاً كشيده ايم مورد بررسي قرار مي دهيم.

 

انواع آنتي بادي

- آنتي بادي پلي کلونال[1]: ملکول آنتي بادي با اپيتوپهاي[2] زيادي از ملکول آنتي ژن، ميل ترکيبي دارد. اين امر ناشي از توليد آنتي بادي توسط کلونهاي مختلفي از سلولهاي لنفوسيت B است.که هر کدام در مقابل يک اپيتوپ از آنتي ژن به ساخت IgG ميپردازند. لذا آنتي باديهاي پلي کلونال شامل IgG هاي مختلفي براي شناسايي و پيوند با اپيتوپهاي متفاوت آنتي ژن است.

2- آنتي باديهاي مونو کلونال[3] : اين نوع آنتي بادي تنها توسط يک کلون ازسلولهاي لنفوسيت B ساخته ميشود. که فقط يک اپيتوب از آنتي ژن را تشخيص داده و با آن پيوند برقرار ميکند. استفاده از

 آنتي باديهاي مونوکلونال براي تشخيص نژادهاي يک ويروس مرسوم است.

---

[1]Polyconolal

[2]Epitop

[3]Monocolonal

آزمونهاي سرو لوژيکي جهت شناسايي ويروسها

آزمونهاي سرلوژيکي جهت شناسايي ويروسها عبارتند از آزمون رسوب در محيط مايع، آزمون رسوب در ژل يا نشت ايمني، آزمون رسوب لوله، آزمون رسوب حلقه، آزمون رسوب ريز، آزمونهاي به هم چسبيدگي، روش تلفيق سرولوژي و ميکروسکوپ الکتروني، و ميکروسکوپ الکتروني با جذب ايمنيISEM ). هرچند روشهاي سرولوژي و تلفيق ميکروسکوپ الکتروني بسيار حساس و براي شناسايي ويروسها مفيدند؛ و در سالهاي اخير از روشهاي مهم در تشخيص ويروسها بوده اند  ولي براي آزمايش تعدادي زيادي نمونه روش عملي به شمار نميروند (). در اين موارد با استفاده از روش بسيار حساس الايزا ميتوان آزمايشات را انجام داد. روش الايزا اولين با توسط ولر و همکاران ابداع شد . تا کنون اشکال زيادي از اين روش براي تشخيص ويروسها مورد استفاده قرار گرفته است.

 

انواع الايزا

- الايزاي مستقيم: در اين روش آنتي بادي آنزيم دار مستقيماً با ويروس باند ميشود. روش ساندويچ آنتي بادي دو طرفه[2] (24) که مورد استفاده قرار ميگيرد نوعي الايزاي مستقيم است. اين تست سرولوژيکي بر روي پليتهاي 96 خانه اي انجام ميشود و در چاهکهاي آن واکنش ميان آنتي ژن با آنتي بادي بررسي ميگردد. در اين روش عکس العمل ميان آنتي ژن با آنتي بادي متصل به آنزيم الکالين فسفاتاز[3] بررسي ميشود وسپس ماده زمينه آنزيم افزوده ميشود و رنگ حاصل از واکنش به طور کمي اندازه گيري ميشود و ويروس در غلظت بسيار پايين شناسايي خواهد شد. چاهکهاي پليت از جنس پلي استايرن بوده که در ابتدا به وسيله گاماگلوبولين خالص شده از آنتي سرم (آنتي بادي) پوشش داده ميشود و سپس نمونه ويروس اضافه ميشود و بعد از آن آنتي بادي متصل به آنزيم افزوده ميشود. آنزيم متصل به آنتي بادي بر روي سوبستراي که در آخر افزوده ميشود اثر کرده و اين آنزيم باعث تجزيه فسفات سوبسترا ميشود که نتيجه آن ظهور رنگ زرد است. اين تغيير رنگ به طريق چشمي يا به وسيله دستگاه ELISA Reader به طور کمي اندازه گيري ميشود. آلکالين فسفاتاز آنزيمي است که اغلب براي اتصال به آنتي بادي مورد استفاده قرار ميگيرد و به وسيله سوبستراي پي نيتروفنيل فسفات شناسايي ميشود. هيدروليز سوبسترا معمولاً با افزودن هيدرو اکسيد سديم به چاهکها و قبل از اندازگيري واکنش رنگ متوقف ميشود.

2- الايزاي غير مستقيم[4]: در اين روش آنتي بادي نشان دار مستقيماً با ويروس باند نميشوند بلکه با يک آنتي بادي اختصاصي ويروس باند ميشود. در اين روش از آنتي باديهاي GAR استفاده ميشود.پس از تزريق آنتي ژن به بدن خرگوش و گرفتن آنتي يادي از خرگوش اين آنتي باديها را به بز تزريق ميکنيم و بز بر عليه اين آنتي باديها که براي بز آنتي ژن محسوب ميشود، آنتي بادي توليد کرده و در آخر اين آنتي باديهاي گرفته شده از بز را نشاندار ميکنيم. که به چنين آنتي باديهايي GAR گفته ميشود. که اين آنتي باديها در صورت برخورد با هريک آز آنتي باديهاي گرفته شده از خرگوش به آن ميچسبند (11). از مزاياي الايزاي غير مستقيم اين است که ترکيب آنزيم وآنتي بادي بز را ميتوان در مرحله سوم الايزاي هر ويروسي به کار برد. به شرط اينکه آنتي باديهاي اوليه که بر عليه ويروس به کار ميروند در خرگوش توليد شده باشند (6). روش NCM ELISA نمونه اي از  نمونه اي از الايزاي غير مستقيم است.

 

---

[1]Direct ELISA

[2]DAS-ELISA

[3]Alkalin phosphatase

[4]Indirect ELISA

برخي ريزجانداران ريزوسفري مؤثر در كنترل بيماريهاي گياهي

                                                       بهنوش قدس علوی

 

	نوع ميكرو ار گانيسم		محل ثبت	هدف
بــــاكتري‌ها
	Agrobacterium radiobacter K84		ايالات متحده آمريكا،استراليا،زلاندنو	گـال طوقه
	Bacillus subtilis		ايالات متحده آمريكا	افزايش رشد
	Pseudomonas fluorescens		استراليا	لكه باكتريايي
	Pseudomonas fluorescens		ايالات متحده آمريكا	بيماري‌هاي گياهچه
قـارچ‌ها
	Peniophora gigantea		بريتانيا	Fomes annosus
	Pythium oligandrum		شوروي سابق	Pythium sp.
	Trichoderma viride		اروپا	عوامل بيماريزاي الوار
	Trichoderma sp.		شوروي سابق	بيماري‌هاي ريشه

                                                  (علوي و آهون‌منش، 1376)

بیماری باکتریا یی:خوشه صمغی گندم

                                                فرزانه آزادی

نام عامل بیماری :Rathayibacter tritici

علائم بیماری:مهمترین علائم آن وجود صمغ وزردی در خوشه آلوده است درخوشه های آلوده گلوم وگلومل ودانه پراز صمغ شده وبه خوشه می چسبند در نتیجه خوشه کوچک شده وگاهی در اثر چسبندگی فراوان خوشه از غلاف خارج نمی شود.رشد کم گیاه وعدم خروج خوشه از غلاف سبب پیچیدگی دم خوشه می شود. در روی برگ ها نزدیک خوشه گاهی نوار طولی بی رنگی که روی آن وجود دارد ظاهر می شود .صمغ ابتدا لزج وچسبنده هستند وسپس خشک وشکننده  می گردند.

منبع: الهی نیا,علی .1372.قارچ شناسی وبیماری مقدماتی گیاهی .انتشارات دانشگاه گیلان 503صفحه.

ارزيابي نتايج اليزا

به منظور ارزيابي نتايج آزمون اليزا از دستگاه Elisa – reader و از طول موج 405 نانومتر استفاده شد. جهت به دست آوردن تغییر‌رنگ واقعي در چاهك ها و حذف جذب نور ديواره چاهك ها و بافر سوبسترا، ‌ميزان نور جذب شده توسط چاهك هاي بلانك از مقدار جذب نور ساير چاهك ها كسر مي گردد كه با دادن شماره چاهك بلانک به دستگاه اين عمل توسط خود دستگاه صورت مي پذيرد. براي تعيين حد آلودگي (R ) از فرمول 3X استفاده مي شود.

بدين منظور 3 برابر ميانگين جذب نور چاهك هاي شاهد (نمونه هاي سالم) محاسبه گرديد، چنانچه ميانگين جذب نور توسط چاهكهاي مربوط به يك نمونه بيشتر از R بود آن نمونه آلوده و اگر كمتر بود آن نمونه عاري از ويروس در نظر گرفته مي شود. ملاك ارزيابي جهت تعيين آلودگي،‌ ميزان جذب نور چاهك ها بعد از 1 ساعت در نظر گرفته مي شود.

 

اصول طراحي آغازگر

1)     در آغازگر اختصاصي، طول آغازگر 18 تا 30 نوکلئوتيد باشد.

2)     حاوي تقريبا" تعداد يکساني از هر نوکلئوتيد باشد.

3)  از تکرار نوکلئوتيد مشابه پشت سر هم و به حالت وصله اي اجتناب شود تا باعث چسبيدن اشتباهي آغازگر روي قالب DNA نشود.

4)  از قرار گيري سه يا تعداد بيشتري G يا C در انتهاي ´3 اجتناب شود، چون اين باعث شروع تکثير اشتباهي  در ناحيه غني از GC مي شود.

5)  ساختار ثانويه در داخل رشته مکمل تشکيل ندهند. از جفت هايي که داراي توالي مکمل در انتهاي ´3 باشند، اجتناب شود. از تشکيل حلقه هاي سر سنجاقي جلوگيري شود.

6)  انتهاي ´3 داراي توالي هايي نباشد که باعث جفت شدن بازها در آغازگرها، آغازگر ها با خودشان يا با هر آغازگر ديگري، بشود و تشکيل فرم Primer-dimer را بدهند.

7)  يک جفت آغازگر که به صورت موفق و عالي کار خود را انجام بدهد، وجود ندارد و بنابراين بعضي از جفت آغازگر ها 100 تا 1000 برابر حساس تر از ديگر آغازگر ها هستند و باعث عدم نتيجه گرفتن و اشتباه شدن نتايج مي شوند، پس چندين ست آغازگر بايد تست شوند.

8)  طراحي آغازگر بايد براساس توالي واقعي اسيد نوکلئيک ها صورت بگيرد. پس اگر قابل دسترسي باشد از برنامه هاي کامپيوتري طراحي آغازگر استفاده شود.

9)  آغازگر ها بايد داراي 55 TM> باشند، در Tm به طور تقريبي به ازاء هر A يا T، 2 درجه سانتي گراد و به ازاء هر G يا C، 4 درجه سانتيگراد اضافه شده، اگر به حالت يونيزه استفاده شود (به ازاء کل بازهاي اضافي) در Tm، دما شرکت داده نمي شود، اما اگر آغازگر هاي فراوان و اضافي استفاده شود کمترين دماي TM محاسبه شده و از آن انجام PCR شروع مي شود.

10) تا جايي که امکان دارد، آغازگر ها با Tm مشابه طراحي شود.

11) آغازگر ها بايد نزديک 200 تا 2000 باز از هم فاصله داشته باشند، اگر کمتر باشد، محصولات خيلي به آساني با پرايمر-پرايمر اتصال پيدا مي کنند و اگر بلند تر باشد، محصولات با راندمان پائين تکثير مي شود.

12) از تواليهاي داراي Oligo(dt) در انتهاي ´3، از 13 اليگو(dt) با A، C يا G، به طرف انتهاي ´3 استفاده شود.

13) اتصال اشتباهي باز T با توالي هدف يا آغازگر، نسبت به ديگر بازها با سرعت و مقدار بيشتري صورت مي گيرد، بنابراين بهتر است که از T در انتهاي ´3 آغازگر براي ايجاد تمايز در DNA، اجتناب شود، براي اطمينان در بيشتر موارد سعي شود در انتهاي ´3 گيره GC باشد.

14) از تکرار سه يا تعداد بيشتري باز مشابه پشت سر هم جلوگيري شود.

 

در بسياري موارد لازم نيست که توالي آغازگر کاملا" مکمل توالي قالب هدف باشد، ناحيه اي در آغازگر که بايد با قالب هدف کاملا" جفت و اتصال پيدا بکند، انتهاي ´3 است. زيرا در اين انتهاي آغازگر، توسعه و تکثير به وسيله DNA-polymerase انجام گرفته و چسبيدن درست به توالي هدف براي عمل کردن اختصاصي بسيار مهم است. عموما" بايد اولين سه نوکلئوتيد انتهاي ´3 کاملا" با قالب هدف جفت شود. انتهاي ´5 آغازگر در تعين اختصاصي بودن و چسبيدن به توالي هدف اهميت کمتري داشته و ممکن است که اين تواليها در بعضي روشها به منظور آسان کردن کلن کردن، دستکاري، موتاژنز، نوترکيبي يا ظهور مجدد در محصولات PCR، تغير بکند. تغيرات معمولي سايتهاي محدود کننده اي را ايجاد کرده که محصولات تکثيري بتواند در ناقلهاي دلخواه به سادگي و با کارائي بالا کلن بشوند. سايتهاي محدود کننده اندونوکلئاز به سادگي مي تواند به انتهاي ´5 اضافه شود و يا مي تواند در طول با آغازگر تغير يک يا تعداد بيشتري نوکلئوتيد توليد بشود. در اين طرح ما از نرم افزار Oligo 5 استفاده شد.

 

Melting temperature(Tm)

Tm دمايي است که در آن نیمی از آغازگر به ناحيه هدف مي چسبند و به عنوان شاخصي براي دماي annealing در PCR است. ساده ترين روش براي اندازه گيري Tm در پرايمرهاي بالاي 200 نوکلئوتيد فاصله، براساس اضافه شدن هر تعداد نوکلئوتيد در پرايمر با استفاده از فرمول زير محاسبه مي شود.

] 2*) تعداد+ (A+T 4*) تعداد  Tm=[(G+C

انجام طراحي آغازگر براي هيبريداسيون اساسا" در 1 مول نمک صورت مي گيرد و اين به طور معني داري بيشتر از آنچه است که در PCR استفاده مي شود. اولين PCR را در دماي Annealing، 5 درجه زير مقدار Tm محاسبه شده قرار دهيد.

 

منابع مورد استفاده:

 

نقوي، م.، قره يازي.ب.، حسيني سالکده.ق.، 1384. نشانگرهاي مولکولي، موسسه انتشارات و چاپ دانشگاه تهران

مصباح.س.ع.، کارگاه بازآموزي و آموزش عملي روشهاي بيوشيمي عمومي و باليني، مهرماه 81، گروه بيوشيمي باليني، دانشگاه تربيت مدرس

 

Mcpherson,M.J., and Moller,S.G.,2000, PCR, Bios Scientific Publishers Limited

 

جمع آوري: عزيزي

توليد گياهان عاري از ويروس

توسعه گياهان عاري ازويروس يکي از مهمترين کاربردهاي بيو تکنولوژي گياهي است. ازنظر پاتولوژيستهاي گياهي کنترل بيماريهاي ويروسي ميتواند به دسته هاي زير تقسيم شود.1- حذف منبع آلودگي ويروس 2- دوري ازبيماريهاي ويروسي که به وسيله ناقلين انتقال پيدا ميکنند. 3- حمله مستقيم به ويروسها 4- توليد واصلاح واريته هاي مقاوم 5 – سازگار کردن روشهاي مخصوص براي تکثير.

خوشبختانه اصلي که وجود دارد اين است که ويروسها به وسيله بذر انتقال پيدا نميکنند و بذرها عاري از ويروس ميباشند. ولي بذرها کمتر مورد توجه براي کارهاي کلون کردن، هيبريد کردن و توليد واريته ها قرار ميگيرند. به دليل اينکه بذرها از نوترکيبي گامتها از طريق تکثير جنسي به وجود ميآيند، داراي هتروزيگوسيتي بالايي هستند و نميتوانند نتاج شبيه والدين از لحظ ژنوتيپي به وجود بياورند . از طرفي گياهاني که از طريق تکثير غير جنسي ازدياد مييابند ميتوانند نتاج شبيه به والدين توليد کنند ولي در تکثير غيرجنسي ويروسها ميتوانند منتقل شوند و جمعيت آنها از يک نسل به نسل ديگر افزايش پيدا ميکند و بعد از 4 تا 6 نسل، گياه 100% آلوده به ويروس ميشود. پس ابتدا بايستي يک پايه عاري از ويروس در گياه توليد کرد و با تکثير و ريز ازديادي آن تعدادي زيادي گياه عاري از ويروس توليد کرد .

توليد ژرم پلاسم عاري از ويروس تخصصي ترين مرحله توليد بذر سالم به شمار ميرود. براي اين منظور در گذشته از روش گزينش کلوني استفاده ميشد. به اين ترتيب که گياهان بدون علائم ويروسي در طي يک دوره گزينش انتخاب و به عنوان هسته اوليه بذري سالم تلقي ميگرديد. در طول دهه هاي گذشته و به دنبال توسعه روشهاي کشت بافت متدهاي مانند کشت مريستم و پروتکلهاي متنوعي مبتني بر کشت بافت ايجاد شده و با سطوح مختلف موفقيت، مورد استفاده قرار گرفتندکه در زير به آنها اشاره ميکنيم.

1- کشت مريستم

 کشت مريستم] اولين تکنيکي بود که به منظور حذف ويروسها در سيب زميني به کار رفت .يکي از متداولترين راههاي حذف ويروسها، جداسازي و کشت مريستم گياه آلوده به ويروس است . در اين روش مريستمهاي به طول 2/0 تا 7/0 ميلي متر در شرايط استريل از جوانه هاي انتهايي يا جانبي ساقه، گياه و يا گياهچه درون شيشه اي جدا و در محيط کشت مخصوص مريستم، کشت داده ميشوند و سپس گياهچه هاي حاصله، از جهت وجود ويروسها تست ميگردند مهمترين دلائل کشت مريستم در حذف ويروسها عبارتند از

1- وجود مواد بازدارنده براي ويروسها در سلولهاي مريستمي .

2-فقدان مواد لازم براي تکثير ويروسها در سلولهاي مريستمي .

3-فقدان سيستم آوندي تکامل يافته در مريستم جهت انتشار ويروسها

4- عدم وجود پلاسمودسماتا در سلولهاي مريستمي براي حرکت ويروسها از سلولي به سلول ديگر.

2- ترموتراپي

 ترموتراپي[ رشد گياه کامل يا کشتهاي درون شيشه اي در دماي بالا است (. که رايجترين روش حذف ويروسها ميباشد. در اين روش گياهان آلوده به ويروس را به مدت مشخصي در دماهاي بالا نگهداري کرده و سپس جوانه هاي جديد آنها را کشت ميدهند و يا از آنها مريستم برداري ميکنند. استفاده از گرما روش موثري براي غير فعال کردن بعضي از ويروسها است. به نظر ميرسد که گرما فقط بر عليه ويروسهاي ايزو متريک و بيمارهاي ناشي از مايکو پلاسما موثر ميباشد . آزمايشات انجام شده بر روي ويروسها و گياهان ميزبان نشان داده که وقتي گياهان با دماي بالا تيمار شدند غلظت ويروس در آنها کاهش يافته است . ظاهراً کاهش ويروس در گياه حرارت درماني شده، در نتيجه اثر منفي حرارت بر تکثير و توزيع ويروسها در گياه ميباشد ترموتراپي باعث ايجاد خلل در سنتز RNA ي تک رشته اي و دو رشته اي ويروس شده و مانع توليد فعاليتهاي پروتئينهاي پوششي و پروتئينهاي حرکتي که در حرکت ويروسها از سلولي به سلول ديگر از طريق پلاسمودسماتا و نيز در مسير طولاني حرکت در سيستم آوندي گياه شرکت دارند، ميشوند (). در خصوص سيب زميني ميتوان گياهان مستقر در گلدان ، گياهچه هاي درون شيشه اي و يا خود غده ها را ترموتراپي کرد. از طرف ديگر ميتوان براي انجام ترمو تراپي از آب گرم استفاده کرد. اين روش براي حذف بند پايان، قارچها، باکترها، و فيتوپلاسما بسيار مفيد است اما براي حذف ويروسها توصيه نميشود.

درمعرض قرار دادن گياهان کامل يا بافتهاي کشت شده به مدت طولاني در درجه حرارتهاي بالا معمولا باعث کند يا متوقف شده رشد طولي و يا مرگ گياهچه ميشود. در نتيجه نرخ بازدهي آن پايين است و ازطرفي محدوديت عمده اين روش اين است که همه ويروسها به اين تيمار حساس نيستند  به عنوان مثال ويروسهاي S , X سيب زميني به راحتي توسط حرارت درماني حذف نميشوند. لذا از روش کشت مريستم به عنوان روش مکمل حرارت درماني استفاده ميشود.

3- شيميو تراپي

شيميوتراپي،] استفاده از مواد شيميايي که بازدارنده ظهور علائم و تکثير ويروس در گياه آلوده ميباشد. به طورکلي شواهد نشان ميدهد که هر چند مواد شيميايي زيادي وجود دارد که از ايجاد علائم و تکثير ويروس ممانعت ميکند ولي مواد اندکي ممکن است وجود داشته باشند که ويروس را ريشه کن کنند.

مواد شيمييايي تحريک کننده رشد، مثل سيتوکنين، ويروس را در مدت کشت مريستم ريشه کن ميکنند ( و غلظت بالاي سيتوکنين، باعث ساخت پروتئين ميزبان بجاي پروتيين ويروس ميشود (. به هر حال مواد شيميايي تحريک کننده رشد ممکن است مستقيماً ويروس را غير فعال نکنند، بلکه ممکن است موجب تحريک مقاومت در گياه ميزبان شده که تحت شرايطي ميتواند ريشه کردن ويروس را موجب شوند .

 از شيميوتراپي به عنوان يک روش جايگزين به جاي حرارت درماني استفاده ميشود. مواد شيميايي مورد استفاده در اين روش باعث ممانعت يا دخالت در نسخه برداري ويروس يا حرکت آن در داخل گياهان شيمي درماني شده، ميشود. در اين روش با استفاده مواد شيمياي مخصوصي در محيط کشت گياهچه ها، يا محلول پاشي، باعث حذف ويروس از آنها ميشوند (. بسياري از ترکيبات ضد ويروسي عمدتاً باعث سنتز آنالوگهاي بازي ميشوند. مهمترين ماده شيميايي مورد استفاده در اين خصوص که نتايج بهتري را هم نسبت به بقيه شامل ميشود ريباويرين است. ريباويرين ريبوزيدي مصنوعي با نامهاي تجاري ويرازول، ويراميد ميباشد .

بنابر گزارشات محققان دانشگاه ديويس ريباويرن باعث افزايش بروز موتاسيون در ويروسها ميشود که اين موتاسيونها بر عليه ويروس عمل کرده و همانند سازي ويروس را متوقف ميكنند. با اين فرض جوانه هاي جديد گياهچه هاي موجود در محيط کشت حاوي ريباويرين، عاري از ويروس ميشوند. مکانيسم دقيق درمان به وسيله شيميو تراپي بخوبي مطالعه نشده است. احتمالاً ريباويرين در مورد ويروسهاي جانوري با ساختار Cap انتهاي 5^/ mRNA ويروس مداخله دارد و بسياري از ويروسهاي گياهي حساس به ريباويرين در انتهاي ^/5 RNA خود داراي Cap هستند. ولي مکانيسم دقيق هنوز مشخص نيست، اگرچه مساله تغييرات ژنتيکي در سيب زميني هاي تيمار شده با مواد شيمياي ضد ويروس گزارش نشده است، اما تمايل براي استفاده اين مواد کاهش يافته است زيرا برخي از گزارشات نشان داده شده که اين مواد ميتوانند سبب موتاسيون در گياه شوند (38 ، 40). وهمچنين قيمت اين مواد بالا ميباشد. بنابراين روش ترموتراپي نسبت به روش شيمي درماني به عنوان يک پيش تيمار قبل از مريستم برداري ترجيح داده ميشود .

-4- الکتروتراپي[

يکي از جديدترين روشهاي پيشنهاد شده براي حذف ويروسها استفاده از جريان الکتريسيته است. که از اين روش براي اولين بار در سال 1996 به منظور حذف PVX در سيب زميني استفاده شد (55). در اين روش از گياهان رشد کرده در محيط گلخانه ساقه هاي با چندين جوانه انتخاب و در معرض جريان الکتريکي در محيط الکتروفورز قرار ميگيرد و بعد از تيمار، نوک جوانه ها جدا و در محيط کشت قرار داده ميشوند. در معرض الکتريسيته قرار گرفتن بافتها موجب افزايش دماي آنها از 4 تا 10 درجه سانتي گراد ميشود (76،55). پاسخ ژنوتيپهاي مختلف به اين روش متفاوت است و باززايي جوانه هاي کشت شده در اين روش متفاوت است (). در اين روش توانايي حذف ويروس يا کارايي درمان (درصد گياهان عاري از ويروس درصد باززايي جوانه ها ) به شدت تيمار الکتروتراپي شده مربوط ميشود. ولي تشکيل گياهچه به شدت تيمار بستگي ندارد و فقط بستگي به ژنوتيپ گياه دارد. نتايج حاکي از آن است که در اين روش از نظر حذف تمامي ويروسها اثر الكتروتراپي در سطح احتمال 1% معني دار بوده است ولي اثر ترکيب ويروسي معني دار نمي باشد. به عبارت ديگر تيمارهاي مختلف الکتروتراپي از نظر حذف تمامي ويروسها متفاوت هستند (4). در اين روش ميزان حذف يک ويروس در ترکيبات ويروسي با کاهش انواع ويروسهاي ديگر افزايش نمي يابد. روش الکتروتراپي از جهت حذف ويروسها به طور يکسان عمل نميکند. بعضي از انواع ويروسها مانند کارلا ويروسها (PVS ) به نسبت کمتري حذف ميشوند. برخي ديگر مانند لوتئو ويروسها(PLRV ) به نسبت بيشتري حذف ميشوند.ممکن است دليل آن مربوط به شکل چند وجهي اين ويروس مربوط باشد . چرا که ويروسهاي ديگر مورد مطالعه از نوع رشته اي انعطاف پذير هستند ).

 با توجه به نتايج به دست آمده کارايي درمان در مورد هر روش محاسبه گرديده است .

کارايي درمان= درصد حذف ويروس x درصد باززايي گياهچه ها

نقش ازتوباكتر در محيط زيست

                                                  بهنوش قدس علوی

ازتوباكتر يك باكتري آزادزي تثبيت كننده نيتروژن است كه انرژي مورد نياز خود را از تجزيه بقاياي گياهي و جانوري تأمين مي‌كند. دو پژوهشگر انگليسي ژني را در گياه Arabidopsis كشف كرده‌اند كه به ريشه‌ها اين توانايي را مي‌دهند كه براي پيدا كردن قطعه‌هاي سرشار از نيترات و نمك‌هاي آمونيوم، خاك را بچشد. فراورده‌ي اين ژن به ريشه‌ها امكان مي‌دهد به جاي جست و جوي تصادفي و پر هزينه، به سوي مواد غذايي رشد كنند. اين دو پژوهشگر براي شناسايي ژن‌هايي كه ممكن است در اين كار دخالت داشته باشند، جهش يافته‌هاي گوناگوني از رشادي را پرورش دادند تا سرانجام جهش يافته‌اي را پيدا كردند كه نمي‌توانست با توسعه‌ي ريشه‌هاي جانبي از ريشه‌هاي اصلي، به جست و جوي نيترات بپردازد. به اين ترتيب آنان ژني را كشف كردند كه براي شناسايي نيترات ضروري است.
 توانايي سنتز اكسين و هورمون‌هاي محرك رشد، انواع ويتامين‌ها به خصوص ويتامين‌هاي گروه B، انواع اسيدهاي آمينه، سنتز مواد ضد قارچي براي مقابله با عوامل بيماريزاي قارچي همانند فوزاريوم، اسكلروتيوم در ريزوكتونياسولاني و … از امتيازات اضافي اين باكتري به شمار مي‌رود. اين ميكروارگانيسم در بسياري از كشورهاي جهان همانند برزيل، هند، روسيه و غيره به عنوان كود بيولوژيك كه ازتوباكترين ناميده مي‌شود براي افزايش كميت و كيفيت بسياري از محصولات كشاورزي همانند غلات، صيفي‌جات و سبزيجات مورد مصرف دارد.
يكي ديگر از موارد استفاده اين باكتري مفيد كه امروزه مورد علاقه بسياري از دانشمندان مي‌باشد نقش اين باكتري در كاهش آلودگي محيط زيست مي‌باشد كه در زير به صورت خلاصه به چندين مورد اشاره مي‌شود.
 نقش ازتوباكتر براي خارج نمودن عناصر سنگين:

 امروزه به منظور خارج نمودن عناصر سنگين (همانند كادميم و سرب) از فاضلابهاي كشاورزي و صنعتي استفاده از تكنولوژي ميكروبي به خصوص گونه‌هاي مختلف ازتوباكتر مورد توجه مي‌باشد كه از نظر اقتصادي و زيست محيطي راهكار مناسبي مي‌باشد. بيوماس و پلي مرهاي ميكروبي نقش مؤثري در خارج كردن فلزات سنگين از فاضلابها دارند. هنگامي كه ازتوباكتر به فاضلابها اضافه مي‌گردد اين باكتري با توليد انواع پلي ساكاريدها كپسول مانند و اگزوپلي ساكاريدهاي سبب خارج شدن ميزان قابل توجهي از عناصر سنگين و مضر همانند سرب، نيكل، كادميوم و … مي‌گردد. به عنوان مثال در تحقيقي در ايتاليا انجام گرفت 6 ليتر از فاضلاب رقيق شده كه حاوي 5 درصد مواد آلي بود با ازتوباكتر وينلاندي در دماي oC30 تلقيح شد پس از 2 هفته بيوماس ميكروبي به وسيله دستگاه سانتريوفوژ جدا گرديد و پلي ساكاريدهاي توليد شده توسط ازتوباكتر نيز عصاره گيري و ارزيابي گرديد. اين پلي ساكاريدها و اگزوپلي ساكاريدها به وسيله غشاء الكلي پلي ونيل بدام انداخته شدند. پلي ساكاريدها عناصر كادميم و سرب را از محلول فاضلاب خارج ساخته بودند. البته نكته قابل توجهي اين مي‌باشد كه ميزان سرب خارج شده از محلول فاضلاب به پ.هاش محلول وابسته مي‌باشد بدين صورت كه در پ.هاش 5/4 راندمان خارج ساختن سرب از محلول فاضلاب ازpH 5/6 بيشتر مي‌باشد. در حاليكه پ.هاش محلول راندمان خارج ساختن سرب از محلول تأثير چنداني ندارد

 

تاریخچه کشت بافت و تولید گیاهان عاری از ویروس

 اساس کار کشت مریستم بر پایه کشف خاصیت Totypotency سلول، یعنی توانایی بازرویی یک موجود کامل از یک سلول است که در سال 1838 توسط شوان و شیلدن بنا شده است. کشت مریستم از اوایل قرن بیستم آغاز شد.  White (1934) اولین کسی بود که روی پراکندگی ویروس TMV در قسمتهای مختلف ریشه توتون کار کرد و حدس زد که مریستم گیاهان می تواند عاری از ویروس باشد (103). Morel (1948) اولین کسی بود که کشت عاری از ویروس مریستم انتهای جوانه را انجام داد و توانست گیاهچه های عاری از ویروس از گیاهان مبتلا به ویروس به دست آورد و فرضیه مصونیت مریستم نسبت به ویروس ها را مطرح کرد. تحقیقات Cornuet & Limasset در 1949 نشان داد که پراکندگی متفاوتی در گیاهانی که به طور سیستمیک آلوده می شوند وجود دارد. آنها با استفاده از روش های بیولوژیک و سرولوژیکی اثبات کردند که غلظت ویروس ها در جوانه ها 150 بار کمتر از برگ های در حال رشد است و این را مطرح کردند که نوک مریستم عاری از ویروس است. در همان زمان Holmes توانست گیاه کوکب را که عاری از ویروس TSWV بود با روش پیوند نوک مریستم روی ساقه زیرزمینی سالم تولید کند. بعد از آن Morel و Martin گیاهان سالمی را از بعضی رقم های گل کوکب و سیب زمینی آلوده به ویروس تولید کردند که با روش برش دادن مریستم و کشت آن در یک محیط کشت مصنوعی انجام شد.

نتایج حاصل از تحقیقات این افراد امکان جدیدی را برای کنترل بیماری های ویروسی فراهم آورد. پس از آن روشهای مختلف درمان گیاه (Therepy) و حذف ویروس مثل گرما درمانی و شیمی درمانی با استفاده از کشت بافت مورد مطالعه و استفاده قرار گرفت.