بررسي پلي‌مورفيسم آنيروزايمي و فعاليت آنزيم پراكسيداز در ارقام خرماي ايران,

شناسايي ارقام خرماي ايران تاكنون صرفا براساس خصوصيات ظاهري رويشي و زايشي استوار گرديده كه بدليل تغييرات اكولوژيكي و غيرقابل استفاده بودن اين ماركرها در تمام طول سال، محققين و اصلاح نباتچيان را با مشكل مواجه نموده است . بنابراين به هدف بدست آوردن ماركرهايي با ثبات بيشتر در مقابل تغييرات محيطي، اين تحقيق به مدت 2 سال و براي اولين‌بار در ايران انجام گرديد. در اين تحقيق از آيزوزايم‌ها و فعاليت آنزيم پراكسيداز بعنوان ماركرهاي بيوشيمي استفاده گرديد. ثابت شده كه با افزايش فعاليت آنزيم پراكسيداز در خرما، مقارمت آن به بيماري "بايد" افزايش مي‌يابد (1996, 1988, 1978 Baaziz) . كليه نمونه‌هاي استفاده شده شامل قطعاتي از برگ كاملا رسيده 40 رقم خرماي ايران بودند براي آيزوزايم‌ها، پس از استخراج آنزيم‌ها با استفاده از موادي همچون ساكارز، EDTA, BSA, PVP, PEGو تيوگليكوليك اسيد در شرايط دمايي 4 درجه سانتي‌گراد، نمونه‌ها را سانتريفيوژ كرده و با استفاده از تكنيك IEF بر روي ژلهاي پلي‌اكريل آميد خيلي نازك ، ران شده سپس ژلها را با چهار رنگ اختصاصي مربوط به آنزيم‌هاي پراكسيداز، شيكيمات دهيدروژناز، اسيد فسفاتاز و ايزوسيترات دهيدروژناز رنگ آميزي شدند. پس از ظهور باندها و خشك شدن ژل، بوسيله دانسيتومتر هلنا- 24 پروسس ، تعداد و شدت باندها تعيين گرديد. جهت تعيين فعاليت آنزيم پراكسيداز، استخراج در دو مرحله صورت گرفت . ابتدا قطعات برگ مربوط به 20 رقم از خرماهاي استان خوزستان را در محلول استون و آب ، له شده و پس از ليوفلايز كردن، با استفاده از بافر تريس و PVPP و در دماي 4 درجه سانتي‌گراد استخراج آنزيم صورت گرفت . عصاره حاصل پس از سانتريفيوژ كردن و افزودن موادي همچون گواياكول بعنوان سوبسترا، به كمك دستگاه اسپكتروفتومتر، ميزان مواد رنگي توليد شده برحسب زمان تعيين گرديد. نتايج حاصل پس از محاسبه به فعاليت آنزيم براساس واحدهاي بين‌المللي تبديل گرديد. جهت تعيين غلظت پروتئين در اين تحقيق از روش لوري استفاده گرديد. نتايج حاصل از بررسي باندهاي آيزوزايمي معلوم ساخت كه آنزيم اسيدفسفاتاز با 21 باند بيشترين تعداد باند را داشته و آنزيم‌هاي پراكسيداز شيكيمات دهيدروژناز و ايزوسيترات دهيدروژناز به ترتيب داراي 18، 17 و 16 باند بودند. اما نسبت باندهاي پلي‌مورفيك به مجموع باندها شامل 2ˆ88 ، 3ˆ83 ، 81 و 5ˆ62 درصد به ترتيب براي شيكيمات دهيدروژناز، پراكسيداز، اسيد فسفاتاز و ايزوسيترات دهيدروژناز ملاحظه گرديد. با بررسي نتايج حاصل از فعاليت آنزيم پراكسيداز معلوم شد كه ارقام معروف و اقتصادي ايران داراي ميزان متوسط تا زياد از فعاليت آنزيم پراكسيداز هستند و ارقامي همچون چبچاب ، خصاب ، بريم، فرسي، سويداني و دگل سرخ فعاليت كل و ويژه كمي از اين آنزيم نشان دادند. بنابراين احتمال مي‌رود كه حساسيت ارقام اخير به بيماري بايد بيشتر باشد.

وظايف اساسي سازمان حفظ نباتات

مبارزه با آفات و بيماريهاي عمومي نباتات و آفات و بيماريهاي قرنطينه?اي داخلي با هزينه دولت و بطور رايگان.

۲-   مشاركت در امور مبارزه با آفات و بيماريهايي كه جزء آفات عمومي نباتات منظور نشده ولي مبارزه با آنها بطور همگاني اعلام مي?شود.

۳-  جلوگيري از ورود و شيوع افات قرنطينه?اي و محدود ساختن آفات قرنطينه?اي داخلي در مناطقي كه شيوع يافته?اند و عنداللزوم انجام مبارزه همگاني جهت رفع آنها.

۴-  راهنمايي كشاورزان و باغداران جهت مبارزه با آفات نباتي از طريق واحدهاي استاني و تدوين برنامه كنترل آفات نباتي با هدف نيل به مديريت مبارزه تلفيقي از طريق ايجاد و گسترش شبكه?هاي مراقبت و سيستم?هاي پيش آگاهي و توسعه روشهاي غير شيميايي بطوريكه حفظ محصولات كشاورزي توام با حفاظت محيط زيست باشد.

۵-  انجام آزمايشات لازم بمنظور كنترل كيفي سموم دفع آفات نباتي.

۶-   انجام آزمايشات كاربردي بمنظور تعيين مناسب?ترين روشها و تكنيكهاي مبارزه با افات نباتي.

۷-  همكاري با دستگاههاي ذيربط در امر نظارت بر انتخاب، ورود، توليد، توزيع و كاربرد ماشين آلات و تجهيزات سمپاشي.

۸-  تشويق در جهت ايجاد شركتهاي خصوصي دفع آفات نباتي.

۹-   صدور پروانه ورود براي انواع بذر _? پياز _? قلمه _? پيوند _? ريشه _? ميوه _? نهال _? تخم و ساير اندامهاي گياهي.

۱۰-صدور پروانه براي تشكيل موسسات و شركتهاي خصوصي دفع آفات نباتي و نظارت بر كار آنان.

۱۱-صدور پروانه ورود، ساخت، تبديل، بسته بندي، توزيع، صدور كليه سموم دفع آفات نباتي، هورمونهاي نباتي، علفكشها، تعيين بهاء براي آنها و نظارت بر حسن اجراي اين امور.

۱۲-  تهيه و انتشار دستور العملهاي فني لازم و همچنين صدور اعلاميه بمنظور جلوگيري از مسموميت انسان و دام در نتيجه عمليات سمپاشي

Fomes annosus)

Arthrobotrys anchonia

Paecilomyces lilacinus

باکتری علیه نماتد(سیکل)

SDS-PAGE پروتئين ها

                                          http://www.iranbiotech.com

سديم دودسيل سولفات"SDS" يک دترجنت آنيوني است که به اغلب مولکولهاي پروتئيني در محلول هاي مايي و درpH  هاي متفاوت متصل مي شود. "SDS" تقريبا" به همه ي پروتئينها با نسبت تقريبي 4/1 گرم در 1 گرم پروتين اتصال مي يابد. براي همين "SDS"  باعث القاء بار الکتريکي منفي متناسب با اندازه در پلي پپتيدها ميگردد. علاوه بر اين "SDS" با تخريب پيوندهاي هيدروژني و بر هم کنش هاي هيدروفوبي, باعث تخريب ساختمان دوم و سوم پروتئين ها مي گردد. در صورت حضور يک ماده ي احيا کننده نظير "DTT"  پيوندهاي دي سولفيدي از گسسته وتاخوردگي پروتئين ها به طور کامل از بين مي رود. پلي پپتيدهايي که شکل طبيعي اشان توسط "SDS"  بر هم خورده و احيا هم شده اند به شکل ميله هايي انعطاف پذير در مي آيند که داراي بار منفي يک دست در واحد طول خود هستند. از آنجا که نسبت بار الکتريکي به جرم مولکولي در اين پلي پپتيدها تقريبا" نسبتي مشابه است, جداسازي پروتئين ها در الکتروفورز تحت چنين شرايطي تقريبا" به طور کامل وابسته به تفاوت در وزن مولکولي آنها است.

برخي پروتئين ها در "SDS-PAGE" رفتاري غيرعادي دارند به خصوص برخي گليكوپروتئين ها به مقادير عادي از "SDS" متصل نمي شوند, در نتيجه نسبت بار الکتريکي به وزن مولکولي در آنها مشابه اين نسبت در پروتئين هاي ديگر نيست و مهاجرت آنها کمتر بوده در نتيجه وزن مولکولي بيشتري از خود نشان خواهند داد.

پروتئين هايي با بارمنفي زياد و يا با  بار مثبت زياد, مثلا" هيستون ها, يا پروتئين هاي غني از پرولين, مثلا" كلاژن, در مجاورت "SDS" بطور غيرطبيعي وزن مولکولي بالايي از خود نشان مي دهند.

ّبه هرحال، "SDS-PAGE" در جداسازي پروتئين هايي با جرم مولكولي خيلي مشابه كه داراي تغييرات بعد از ترجمه, نظير استيليشن يا متيليشن يا فسفروريليشن, هستند از ارزش کمي برخوردار است. براي آناليز چنين پروتئين هاي تغيير يافته اي ، از روش PAGE با اوريک اسيد استفاده مي شود كه در آن هم وزن مولكولي و هم بار پروتئين در فرآيند جداسازي دخيل است . پروتئين در pH اسيدي بار مثبت دارد و در ميدان الكتريكي به سمت كاتد حركت مي كند . به اين دليل از روش PAGE اسيداوره عموماً براي جداسازي پروتئين هايي با سايز يكسان و بار متفاوت استفاده مي شود.

 

مشكلاتي كه ممكن است درحين آماده سازي و كار با ژلSDS بوجود آيد:

 

 

مشكل	علت	چارة كار
كاهش ميزان پليمريزاسيون ژل	وجود اكسيژن ، كهنه بودن محلولهاي استوک  ( بخصوص آكريل آميد و امونيوم پرسولفات )	محلولها را degas كنيد. مجدداً محلول استوک تهيه كنيد .
تشكيل انتهاي چسبنده ژل	نفوذ n-butanol به ژل.	محلول ژل را با n- بوتانل بپوشانيد بدون اينكه مخلوطشان كنيد .
نارضايتي از نتيجه رنگ آميزي، رنگ آميزي ضعيف	رنگ بطور مطلوب باند با نمونه نشده است	از محلول غليظ تر رنگ استفاده كنيد . زمان رنگ‌آميزي را افزايش دهيد و يا از رنگي با حساسيت بالا استفاده كنيد. محلول رنگي مي بايستي حاوي محلول ارگانيك ( مثل متانول ) باشد كه SDS را از پروتئين جدا كند چراكه ممكن است رنگ به آن بچسبد .
رنگ يكدست نيست	نقوذ رنگ و يا رنگ بري بصورت يكدست انجام نشده است .	ژل را درطي رنگ آميزي و رنگ بري تكان دهيد . زمان رنگ آميزي و رنگ بري را افزايش دهيد .
باندها رنگ نگرفته اند .	رنگ پروتئين حذف شده است.	ژل را مجدداً رنگ كنيد . زمان رنگ بري را كم كنيد و يا از رنگي استفاده كنيد كه پروتئين را طوري رنگ كند كه رنگش محو نشود ..
بر روي ژل نشانه هايي از رنگ در نواحي غيراختصاصي مشاهده مي شود	درمحلول رنگي ، رنگ به صورت جامد و حل نشده باقي مانده و مشاهده  مي شود .	از حل شدن كامل رنگ اطمينان حاصل كرده يا اينكه رنگ را پيش از استفاده فيلتر كنيد .
آلودگي بطور وضوح مشاهده مي شود .	وسايل و يا محلولهاي استوک آلوده هستند . مواد غيرپروتئيني در نمونه رنگ گرفته اند ( به عنوان مثال اسيدنوكلئيك )	وسايل را تميز كرده يا از وسايل نو استفاده كنيد. از رنگ ديگري استفاده كنيد كه آلودگي ها را رنگ ننمايد .
تفكيك باندهاي پروتئيني بخوبي انجام نگرفته است .	الكتروفورز ناكارآمد . سايز Pore (‌حفره ) ژل جداكننده مناسب نيست . ميزان load شده تا ميزان زيادي عوض شده است	درصد C و T ژل جداكننده را تغيير دهيد . هربار از ميزان Loading يكساني استفاده كنيد .
هر از گاهي تغييرات جزئي درحركت الكتروفورتيك پروتئينهاي استاندارد مشاهده مي شود .	اجزاء سازنده ژل به لحاظ كيفي از Batch به Batch ديگر با گذشت زمان تغيير مي كند .	از يك Batch ماده شيميايي تا حداكثر زمان ممكن استفاده كنيد و محلولهاي Stock دترجنت هاي كهنه را عوض كنيد .
كج و معوج شدن باندها ، باندها پخش يا رگه دار شده باشد .	پروتئينهاي نمونه در حلال غيرقابل حلند ، يا بصورت مجتمع aggregate باقي مانده اند . يك عامل حل نشده است يا حباب موجود در ژل با باند پروتئيني درحال حركت درگير شده است .	از حلال تازه با SDS اضافي و عوامل كاهنده  استفاده كنيد بخصوص براي محلولهاي مربوط به نمونه تغليظ شده . محلول Stock را پيش از استفاده فيلتر كنيد و هرگونه حبابي را از ژل خارج كنيد .
مهاجرت پروتئيني يكپارچه نيست ( باندها خم مي شوند )	سايز حفرات ژل يكسان نيست . بخشي از ژل درگير نشده است . نشت الكتريكي (برق دزدي). خنك كردن ژل يكپارچه نيست ( در نتيجه يك بخش سريعتر از بخش ديگر حركت مي كند ) .	مطمئن شويد كه محلولهاي ژلي بخوبي مخلوط شده اند و پليمريزاسيون خيلي به سرعت انجام گرفته ( براي كاهش زمان پليمريزاسيون پرسولفات را كاهش دهيد . قبل از الكتروفورز هر حبابي را كه به ژل چسبيده حذف كنيد . مطمئن شويد كه اسپيسهاي كناري درجاي مناسب قرارگرفته اند . سيستم خنك كننده ژل را بهبود بخشيد يا ميزان گرما را با كاهش ولتاژ يا قدرت يوني بافر كاهش دهيد .

  

 

 

مباني الکتروفورز

                                             http://www.iranbiotech.com

الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان شبکه اي متخلخل حركت مي کنند. سرعت حرکت مولکولها در اين شرايط نه تنهاتحت تاثير بار الکتريکي اشان است بلکه عواملي ديگري نظير اندازه و شکل مولکول نيز در اين امر دخيل هستند. به همين دليل الکتروفورز روشي مناسب و کارآمد در جداسازي مولکول مورد استفاده قرار مي گيرد. معمولا" الکتروفورز براي جداسازي مولکولهاي بزرگي چون پروتئين ها و اسيدهاي نوکلئيک به کار برده مي شود, اما در مواردي نيز براي جداسازي مولکولهاي باردار کوچکتري نظير قندها, اسيدهاي آمينه, پپتيدها و حتي يونهاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد.

معمولا" براي الکتروفورز يک مخلوط مولکولي, لايه نازکي از آن, بر روي شبکه اي متخلخل که محلولي را درون خود محبوس کرده است, قرار داده مي شود. پس از برقراي ميدان الکتريکي با اِعمال اختلاف پتانسيل در دو سوي اين شبکه, مولکولهاي موجود در نمونه با سرعت هاي متفاوتي درون شبکه متخلخل شروع به حرکت مي کنند. اين اختلاف سرعت مبناي جداسازي در الکتروفورز است. در پايان, مولکولهاي پروتئيني مختلف به صورت باند هايي مجزا در قسمت هاي مختلف شبکه آشکار مي شوند. شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکولها در اثر گرماي ايجاد شده به خاطر جريان الکتريکي نقش مهمي دارد. علاوه بر اين در مواردي که از ژل هاي آگاروز و پلي آکريل آميد استفاده مي شود, شبکه متخلخل نقش يک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکولها را نيز ايفا مي کند.

در اغلب دستگا ه هاي الکتروفورز, ژل مابين دو محفظه ي بافري قرار مي گيرد به طوريکه ژل تنها واسطه در عبور جريان الکتريسيته بين اين دو محفظه باشد (شکل 5-1).

شکل 5-1- شمايي از سيستم الکتروفورز

جداسازي توسط الکتروفورز تحت تاثير عوامل متعددي قرار دارد. ماهيت مولکولهاي نمونه نظير بار الکتريکي و اندازه آنها و شدت جريان و ميدان الکتريکي و بالاخره اثرات محيطي نظير نوع و نحوه ي استفاده از بافرها و حرارت ايجاد شده در حين کار عواملي هستند که بر نحوه ي جداسازي مولکولهاي نمونه اثر مي گذارند.

5-1-1-1-  اثر عوامل الکتريکي

در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول ها تناسب مستقيم با اختلاف پتانسيل اِعمال شده دارد. قانون اُهم  Ohm در الکتروفورز از اهميت زيادي برخوردار است (معادله 5-1)

V=IR

معادله 5-1- قانون اهم؛ V ولتاژ يا اختلاف پتانسيل برحسب ولت, I شدت جريان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است

معادله فيزيکي ديگر که از آهميت برخوردار است, معادله توان است. اين معادله مقدار حرارت ايجاد شده در حين الکتروفورز را مشخص مي کند.

P=V²/R يا P=I²R يا P=VI

معادله 5-2- معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است.

اين حرارت ايجاد شده بر اثر مقاومتي است که الکترودها, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرماي ژول Joule heat موسوم است. منابع الکتريکي Power supply مورد استفاده در الکتروفورز ايجاد جريان مستقيم مي کنند و معمولا" يکي از پارامترهاي الکتريکي,يعني ياجريان يا اختلاف پتاتسيل يا توان را ثابت نگاه مي دارند. بايد توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده در الکتروفورز را به هر حال نمي توان ثابت نگاه داشت. براي مثال در حين الکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرماي ژول, کاهش مي يابد. بنا بر نوع بافر بکار رفته و پارامتر الکتريکي که ثابت نگاه داشته مي شود, گرماي ژول در حين انجام الکتروفورز ممکن است کاهش يا افزايش يابد (جدول 5-1). براي مثال در "SDS-PAGE" ناپيوسته ثابت نگاه داشتن شدت جريان منجر به افزايش دما مي شود که نياز به سيستم خنک کننده را در چنين وضعيتي الزامي مي کند.

جدول 5-1- تاٍثير ثابت نگاه داشتن پارامترهاي الکتريکي در سيستم هاي بافري مختلف

 

انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز, با در نظر گرفتن متغير هاي مختلفي صورت مي پذيرد. براي مثال مدت زمان مورد نظر براي انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ مي دهد, و نياز به حفظ دماي خاص براي انجام الکتروفورز. معمولا" پروتئين ها با جريان ثابت الکتروفورز مي شوند, در حاليکه الکتروفورز اسيد هاي نوکلئيک با ولتاژ ثابت انجام مي شود.

5-1-1-1- اثر سيستم هاي بافري و pH

پروتئين ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH  محيطي که در آن قرار داشته باشند بارالکتريکي خاص خود را نشان مي دهند. بدين ترتيب در جداسازي توسط الکتروفورز بايد pH  محلول هاي  مورد استفاده ثابت باقي بماند از آنجا که الکتروليز آب در آنود يونهاي "H⁺" و در کاتود يونهاي "OH^-" ايجاد مي کند, براي ثابت نگاه داشتن pH محلولهاي مورد استفاده, آنها بايد بافر شوند.

5-1-1-2- اثر حرارت

براي حفظ تکرار پذيري, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مهم است. براي مثال پلي مريزه شدن آکريل آميد يک واکنش گرمازا است, از اينرو گرماي ايجاد شده در حين پلي مريزاسيون, به خصوص در مورد ژل هاي غليظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بي نظمي در اندازه ي منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولا" مشکلي در ژل هايي با غلظت کمتر از 15% T نمي کند. به هر حال گرماي زياد در حينالکتروفورز مشکلات ديگري را نيز پديد مي آورد؛ شکستن شيشه هاي الکتروفورز, آسيب به دستگاه. وقتيکه حرارت بصورت يک دست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهاي جدا شده نامنظم » شود و در اصطلاح باندها خندان مي شوند چون نمونه ها در رديف هاي وسط سريع تر از رديف هاي کناري حرکت خواهند کرد.

5-2-      الکتروفورز با ژل پلي آکريل آميد

اكثر روش هاي مربوط به تفكيك پروتئين ها كه امروزه از آنها استفاده مي شود بر مبناي الكتروفورز منطقه اي يا ناپيوسته ژل هاي پلي آكريل آميد استوار است . الكتروفورز منطقه اي  روي ژل پلي آكريل آميد تحت عنوان "PAGE" شناخته مي شود. در اين روش از تفاوت وزن مولكولي و بارالکتريکي پروتئين ها به طور همزمان براي تفکيک آنها از يکديگر استفاده مي شود.

اساس اين روش بر مبناي حركت مولکولهاي باردار در يك ميدان الكتريكي مشخص است. مشخصات ميدان الکتريکي نظير اختلاف پتانسيل، فاصلة بين الكترودها ، مشخصات مولکول نظير بار الکتريکي, اندازه و شكل مولكول ، و عوامل ديگري نظير دما و زمان بر نحوه ي انجام اين روش تاثير مي گذارند.

درسيستم ناپيوسته "Laemmli" دو نوع ژل وجود دارد: ژل رديف کننده و ژل تفکيک کننده Resolving  ژل رديف کننده ژلي با طول کم و با منافذ بزرگ است كه در بالاي ژل بلند و با منافذ كوچك تفکيک کننده قرار مي گيرد. در سيستم "Laemmli" ژلهاي رديف کننده و تفکيک کننده با تو جه به تركيب بافريشان نيز ناپيوسته اند.

اين دو پارامتر ; بافرهاي متفاوت و تركيب آكريل آميد متفاوت به نمونه هايي با حجم نسبتاً بزرگ اين اجازه را مي دهد كه در بخش بالاي ژل رديف کننده متمركز شوند پيش از آنكه بواسطة ورود به ژل پائيني تفکيک کننده عمل جداسازي رويشان انجام گيرد.

مزيت مهم ژل رديف کننده توانايي آن در تمركز پروتئين نمونه هاي بسيار رقيق است . اين كار بطور مؤثري تفكيك مراحل بعدي را بهبود مي بخشد چراكه نمونة اصلي در ناحية خيلي باريك و بسيار متمركزي جمع مي شود و همة مولكولهاي پروتئيني جداسازي الكتروفورتيك خود را تقريباً از يك نقطه شروع مي كنند.

رديف شدن  ناشي از ايجاد يك گراديان محدودو با ولتاژ بالا است كه در آن پروتئين ها مقيد به يك ناحية باريك كاملاً متمركز بين يونهاي كلرايد پيشتاز و گلايسين دنباله رو مي شوند. وقتي جريان الكتريكي از نمونه عبور مي كند، يون كرايد از ساير يونها كه حركت آرامتري دارند ( مثلاً گلايسين ) سريعتر مهاجرت مي كند. يون هاي نمونه با حركت حد واسط خود بين يونهاي كلريد و گلايسين كمپرس شده و در نتيجه  يك ناحية باريك يا باندي شكل بسيار متمركز ايجاد مي شود. بنابراين ژل رديف کننده قادر است  پروتئين ها را بصورت باندي باريك ساندويچ كند. براي انجام جداسازي الكتروفورتيك، پروتئين ها بعد از انباشته شدن روي يكديگر از آن محدوده جدا شوند. تفكيك بدون رديف کردن و با با افزايش ناگهاني pH و كاهش قطرحفرات ژل نيز امكان پذير است . تحت اين شرايط ، يونهاي نمونه به ژل تفکيک كننده مهاجرت كرده و يونهاي عقب دنباله رو ( گلايسين ) متناوباً از يونهاي نمونه پيشي گرفته و جلو مي زنند. بنابراين گراديان ولتاژ نسبتاً ثابتي ايجاد مي شود كه در آن جداسازي الكتروفورتيك نمونه رخ مي دهد.

5-2-1-     نحوه ي ايجاد منافذ با اندازه هاي متفاوت

ژل پلي آكريل آميد محدودة گسترده اي از اندازه هاي حفرات ژلي را دربر مي گيرد .

 

ژل پلي آكريل آميد با پليمريزاسيون آكريل آميد مونومريك و مونومر ايجاد كنندة پيوند متقاطع  Cross linker, بيس آکريل آميد شكل مي گيرند( شکل 5-2).

 

شکل 5-2- نحوه ي پلي مريزاسيون آکريل آميد

پليمريزاسيون آكريل آميد و بيس آكريل آميد مي تواند به صورت شيميايي, با  تترامتيل اتيلن ديامين N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) و آمونيوم پرسولفات, يا سيستم فتوشيميايي باشد.

راديكالهاي آزاد پرسولفات كه با حل آمونيوم پرسولفات در آب ايجاد مي شوند مونومر آكريل آميد را فعال كرده و "TEMED" در اين واكنش با انتقال الكترون اين واكنش را كاتاليز مي كند . در عين حال ريبوفلاوين مي تواند در حضور اكسيژن و اشعة UV راديكال آزاد توليد كند . بعضي مواقع از ريبوفلاوين و آمونيوم پرسولفات براي ايجاد راديكالهاي آزاد استفاده مي شود.

اندازة منافذ ژل عامل اصلي در تعيين قدرت تفكيك پروتئين ها و پلي پپتيدها در ژلهاي پلي آكريل آميد است. اندازه ي منافذ با دو پارامتر مشخص مي شوند: محتواي کل ماده ي جامد يا %T ونسبت مونومر ايجاد کننده ي پيوند متقاطع به مونومر آکريل آميد يا %C.

 

شکل 5-3- تعيين %T و %C در ژلهاي پلي آکريل آميد

بدين ترتيب پليمرهاي آكريل آميد مي توانند منافذي با اندازه هاي بسيار متفاوتي را ايجاد کنند. با تغيير در غلظت آكريل آميد و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه ي منافذ امکان پذير است. براي مثال، با افزايش نسبت پيوندهاي متقاطع ، اندازه ي منافذ كاهش مي يابد. انتخاب دقيق و درست غلظت ژل آكريل آميد براي جداسازي بهينه پروتئين ها در الكتروفورز ضروري است(جدول 5-2(.

محدوده اندازه ي مولکولي قابل تفکيک (kD)	درصد آکريل آميد در ژل
205-36	5%
205-24	5/7%
205-14	10%
66-14	12%
45-14	15%

جدول 5-2- در صد آکريل آميد براي جداساژط پروتئين هايي با اندازه هاي مختلف

نکات ديگري نيز در نحوه ي پلي مريزه شدن موثرند, براي مثال با افزايش دماي پليمريزاسيون، ميزان پليمريزاسيون افزايش مي يابدو اندازه ي منافذ ژل كوچك مي شود. درحاليكه كاهش دماي پليمريزاسيون مي تواند ژلهايي با منافذ بزرگ توليد كند. عواملي كه كارايي تبديل مونومر به پلي مر را تحت تأثير قرار مي دهند نيز مي توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثير قرار دهند. براي مثال ، استفاده از آكريل آميد كيفيت پائين و نيز pH بسيار بالا يا پايين سبب تبديل ناكامل مونومر به پلي مر شده و سبب ايجاد منافذ بزرگي در ژل شود. مواد افزودني ژل نيز مي تواند بطور قابل توجهي ساختار منافذ ژل را تحت تأثير قرار دهدمثلاً اوره 8 مولار سبب ايجاد ژلهايي با منافذ کوچک مي شود, چون سبب تسهيل پليمريزاسيون كامل مي شود.

 

SDS-PAGE

سيستم بافري ناپيوسته Non continous  كه توسط "Laemmmli" در سال 1970 معرفي شد، رايج ترين روشي است كه براي بعد دوم الكتروفورز دوبعدي بكارگرفته مي شود. ژلها يا داراي غلظتي مشخص از پلي آكريلاميد يا حاوي شيبهاي غلظتي از پلي آكريلاميد هستند. نوارهاي "IPG" بعد از متعادل سازي مستقيماً بر سطح ژلهاي بعد دوم "SDS-PAGE" قرار داده مي شوند كه اين ژلها مي توانند عمودي يا افقي باشند.

در مورد روشهايي كه از سيستم هاي افقي براي بعد دوم استفاده مي شود اين مزيت وجود دارد كه چون  ژلهاي "SDS-PAGE" بر روي يک صفحه ي پلاستيكي متصل هستند, در نتيجه از تغييرات در اندازة ژل در حين رنگ‌آميزي ممانعت بعمل مي آيد. در روش افقي نقاط در مقايسه با آن چيزي كه از سيستم عمودي گرفته مي شود داراي وضوح بيشتري هستند. اين امر به دليل قطر کمتر ژلها مي باشد كه معمولاً در سيستم افقي 5/0 ميلي متر است درحاليكه در سيستم عمودي بين 5/1-1 ميلي متر است. قطر کم استفاده از ولتاژهاي بالاتر را ممکن مي سازد و درنتيجه انتشار پروتئينها در حين الکتروفورز كمتر است. اما مزيت ژلهاي "SDS-PAGE" عمودي در امکان انجام چندين تجربه به طور هم زمان است که درآناليز پروتئوم کمک به افزايش تكرارپذيري نمايه ي پروتئيني الكتروفورز دوبعدي را مي نمايد. در سيستم هاي عمودي نياز به استفاده از ژلهاي رديف کننده Stacking نيست زيرا مناطقي كه پروتئينها در آن فوكوس شده اند در داخل نوارهاي IPG قبلاً تغليظ شده‌اند.

"SDS-PAGE" علاوه بر استفاده گسترده در الکتروفورز دو بعدي, يكي از قابل اعتمادترين روشهاي موجود براي جداسازي پروتئين در مخلوط هاي پروتئيني و نيز ارزيابي خلوص پروتئين است. كاربردهاي ديگر "SDS-PAGE" كه در تحقيقات مربوط به تعيين ساختار پروتئين و پروتئوميكس مطرح مي شود عبارتند از:

• تعيين جرم مولكولي نسبي (Mr)

• مشخص كردن غلظت پروتئين

• شناسايي تغييرات پروتئين

• تعيين نقشه پپتيدي با استفاده از هضم پروتئوليتيك جزئي در ژل رديف کننده.

• مرحلة اول ايمونوبلاتينگ با انتقال الكتروفورتيك به ماتريكس

• تلفيق با روشهاي پروتئوليتيك با توان عملكردي بالا براي توالي يابي  مستقيم پايانه هاي كربوكسي ـ آميني و يا تلفيق هضم پروتئوليتيك بر روي ژل و اسپكتروفوتومتري جرمي براي تعيين هويت پروتئين است.

اگرچه اكثر محققان هنوز از روش تكنيك هاي رنگ آميزي كوماسي  برليانت بلو ،‌ نيترات نقره و همچنين برچسب هاي راديواکتيو استفاده مي كنند، استفاده از روشهاي پيشرفته جديد با حساسيت بالا در بصري سازي پروتئين بخصوص روشهاي رنگ آميزي فلورسانس ، حساسيت كلي آشكارسازي پروتئين ها را در روي ژل پلي آكريل آميد بالا برده است.

مقايسه روشهاي سرلوژيكي براي شناسايي و رديابي باكتري عامل سوختگي معمولي لوبيا در استا ن مزكزي

                    محمد رضا لك، مسعود بهار، مسعود شمس بخش

Comparison of seological methods for identification and detection of causal agent of bean common bacterial blight in bean seed in Markazi province

در اين بررسي آزمونهاي سرلوژيكي نشت دو طرفه در آگار و روش غير مستقيم اليزا جهت شناسايي ‏‎Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli, Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap)‎‏ ‏‎,Var fuscans (Xapf),‎ و رديابي آنها در بذور لوبيا مقايسه شدند آنتي سرمها با استفاده از سلولهاي زنده و تثبيت شده با فرمالين جدايه هاي ‏‎Xapf-3,Xap-14‎‏ تهيه گرديدند. آنتي سرمهاي تهيه شده در هر دو آزمون نشست دو طرفه در آگار و روش غير مستقيم اليزا داراي واكنشهاي اختصاصي بود و با ساير باكتريها و يا نژاد هاي متفاوتي از جنس ‏‎Xanthomonas‎‏ عكس العملي نداشتند گرچه روش نشت دو طرفه در آگار روش مناسبي براي نشاسايي ‏‎Xap,Xapf‎‏ ارزيابي گرديد و امكان تفكيك جدايه هاي ‏‎xap,xapf‎‏ از همديگر با استفاده از زانتومونادين استخراجي آنها فراهم شد ولي جهت تشكيل باند هاي رسوبي غلظت زيادي از سوسپانسيون باكتريايي (در حدود بالاتر از 10 بتوان 8 سلول در هر ميلي ليتر) لازم بود در روش غير مستقيم اليزا جمعيت كمتري از باكتري (حدود 10 بتوان 5 سلول در هر ميلي ليتر ) قابل تشخيص بود. كاربرد روش غير مستقيم اليزا براي تعيين حضور ‏‎Xap ‎‏ در بذور آلوده طبيعي نشان داد كه روش مزبور مي تواند به عنوان يك روش مناسب و حساس براي شناسايي و رديابي عامل بيماري سوختگي باكتريايي لوبيا در بذر بكار گرفته شود.

اثر كودهاي آلي و شيميايي روي نماتود Meloidogyni javanica در خيار

                                  مهدي نصر اصفهاني ، عليرضا احمدي  

کودهاي آلي، شامل کودهاي نپوسيده دامي، مرغي، کود سبز، کمپوست، کودهاي شيميايي (NPK) بطور جداگانه و در تلفيق با کودهاي آلي در کنترل نماتودهاي ريشه گرهي گونه ي غالب، Meloidogyne javanica روي خيار رقم P.S نشان داد که تلفيق کود مرغي و شيميايي (NPK) از موثرترين تيمارها در کاهش تعداد تخم و نوزاد نماتود در خاک و ريشه بوده است. همچنين کاهش جمعيت تعدادي از نماتودهاي انگلي ديگر و نيز ازدياد جمعيت نماتودهاي آزادزي نسبت به شاهد شده و بيشترين ميزان رشد و نمو گياه نيز در اين تيمار بود. تيمارهاي کود مرغي، تلفيق کودهاي حيواني و سبز با کودهاي شيميايي، کود حيواني، کودهاي سبز و کمپوست بترتيب در رده هاي بعدي قرار گرفتند. ساير تيمارها شامل کودهاي شيميايي NPK نيز اثرات اندکي در کاهش تعداد تخم و نوزاد نماتود M. javanica نسبت به شاهد داشتند .

سوزاندن بقاياي گياهي موجب ضعيف شدن خاك مي‌شود

دكتر كامبيز بازرگان رييس بخش آزمايشگاههاي موسسه تحقيقات خاك و آب :

سوزاندن بقاياي گياهي موجود در مزارع موجب ضعيف شدن خاك مي‌شود.

برخي كشاورزاني كه به روش سنتي به فعاليت كشاورزي مشغول هستند طبق سنت ديرينه بعد از هر برداشت محصول از مزرعه، بقاياي محصول را مي‌سوزانند. درحالي كه اين عمل برخلاف اعتقاد آنان كه موجب قوت زمين مي‌شود، سبب ضعيف شدن زمين زراعي خواهد شد.  با سوزاندن بقاياي گياهي در مزرعه بخش مهمي از عناصر غذايي و هيدروكربن‌ها كه تركيباتي اساسي در تقويت خاك و رشد محصول هستند ضعيف و براثر تداوم اين كار از بين مي‌روند.

سوزاندن بقاياي گياهي آلودگي را نيز هم همراه دارد. 

 ميزان جمع شدن مواد معدني در بخش‌هاي ساقه و برگ گياه بيشتر از بخش ميوه آن است بنابراين سوزاندن بقاياي گياه به منزله از بين بردن بخش اعظمي از مواد معدني و عناصر سازنده خاك است.

 در دنيا مكانيسمي وجود دارد كه بقاياي گياهان را آتش نمي‌زنند بلكه دوبار به خاك برمي‌گردانند. 

 با ادامه عمل سوزاندن بقاياي گياهي در مزارع، بعد از گذشت ‪ ۲۰‬تا ‪ ۳۰‬سال خاك سفت و قابليت باروري آن كاهش مي‌يابد كه در اين مرحله مجبوريم از كودهاي شيميايي استفاده كنيم.

 استفاده مداوم از كودهاي شيميايي علاوه بر عوارض شيميايي و اثراتش بر روي انسان، موجب شور شدن خاك و در نهايت پايين آمدن قابليت توليد در خاك مي‌شود، بنابراين مي‌توان با يك سازوكار درست از بقاياي گياهي به عنوان بهترين كود استفاده كرد

طبقه بندي اسيدهاي آمينه

پروتئینها درشت مولکولهایی هستند با وزن مولکولی 5000 دالتون که از پیوند کووالانسی یک سری واحدهای ساختاری به نام اسیدهای آمینه ساخته شده‌اند. تعداد ،‌ ماهیت و طرز قرار گرفتن این واحدها در زنجیره پروتئینی ساختار خاص و رفتار ویژه آنها را تعیین می‌کند. در ساختار این مولکولها ، هم عامل آمین و هم عامل کربوکسیل وجود دارد که هر دو به کربن مرکزی به نام کربن آلفا متصل‌اند. همچنین به کربن آلفا ترکیبی به نام زنجیره کناری که با حرف R نشان داده می‌شود و یک مولکول هیدروژن متصل شده است.

اشکال مونومری ، که واحدهای ساختاری پروتئینها را می‌سازند، شامل 20 نوع اسید آمینه متفاوت است که از نظر ویژگیهای گروه R مانند اندازه ، بار الکتریکی و حلالیت و غیره تفاوت دارند. هنگامی که پروتئینها در اسید یا باز قوی جوشانده می‌شوند، اتصال بین واحدهای مونومری آنها شکسته شده و اسیدهای آمینه آزاد می‌گردند.
طبقه بندی اسیدهای آمینه استاندارد
تعداد 20 اسید آمینه موجود در یاخته به نام اسیدهای آمینه استاندارد موسوم‌اند. برای اسیدهای آمینه استاندارد طبقه بندیهای مختلفی داده شده‌اند و از بین آنها نوعی که امروزه مورد استفاده است طبقه بندی بر حسب وضعیت بارداری گروه R است. بدین ترتیب چهار گروه اصلی را می‌توان در نظر گرفت.


گروه اول: اسیدهای آمینه با گروه R ناقطبی
در این دسته 8 اسید آمینه قرار می‌گیرند. این اسید آمینه به علت نداشتن گروههای باردار یا قطبی بسیار آب گریز بوده و به آب گریزی نیز معروف‌اند. آلانین سر دسته این گروه بوده و پس از گلیسین ساده‌ترین اسید آمینه یاخته‌ای است. آلانین در بخش R خود یک گروه متیل دارد. با افزوده شدن عوامل متیل اضافی به آلانین ، اسیدهای آمینه دیگر مانند والین ، لوسین و ایزولوسین ساخته می‌شوند. زنجیره کناری می‌تواند ساده یا منشعب باشد.

میزان آب گریزی از آلانین به طرف ایزولوسین افزایش می‌یابد. اسیدهای آمینه تریپتوفان و فنیل آلانین در زنجیره کناری خود عامل حلقوی مانند فنیل و ایندول دارند. اسید آمینه متیونین در گروه R واجد یک عامل گوگردی است که بوسیله یک گروه متیل پوشیده می‌شود. پرولین از اسیدهای آمینه ویژه‌ای است که چون در آن عامل آمین متصل به کربن آلفا با زنجیره کناری به صورت حلقه درآمده است از بقیه اسیدهای آمینه مستثنی می‌شود، در نتیجه پرولین را ایمنو اسید می‌نامند.
گروه دوم: اسیدهای آمینه با گروه R قطبی ولی بدون بار
سر دسته این گروه از اسیدهای آمینه گلیسین است که به علت داشتن زنجیره کناری ساده از نوع هیدروژن متقارن بودن کربن آلفا ، از سایر اسیدهای آمینه متمایز می‌شود. سرین و ترئونین به علت داشتن گروه الکلی در مولکول با مولکولهای آب پیوند هیدروژنی ایجاد می‌کنند و به آسانی در آن حل می‌شوند. تیروزین واجد زنجیره کناری حلقوی است که یک عامل هیدروکسیل به آن متصل شده است و بدین سبب بیش از بقیه قطبی است. زنجیره کناری سیستئین به عامل (SH) ختم می‌شود. این اسید آمینه می‌تواند به دو شکل اکسید و یا احیا در مولکول پروتئین دیده شود.

اگر عامل گوگرد احیا شده باشد این مولکول سیستئین نامیده می‌شود در صورتی که دو مولکول سیستئین در مجاورت هم قرار گیرند بین آنها پیوند کووالانسی ایجاد می‌گردد. بدین ترتیب ، پیوندهای حاصل پیوند دی‌سولفید و ترکیب مربوطه سیستین نامیده می‌شود. پیوندهای دی‌سولفید در ایجاد و پایداری ساختار سوم پروتئینها نقش اساسی دارد. دو اسید آمینه آسپاراژین و گلوتامین که شکل آمین در آنها به ترتیب اسیدهای اسید آسپارتیک و اسید گلوتامیک هستند، حد واسط بین گروه دوم و سوم به شمار می‌روند این دو اسیدآمینه در آب محلول و بسیار قطبی هستند.


گروه سوم: اسیدهای آمینه با گروه R قطبی و بار منفی
در این گروه دو اسید آمینه اسید گلوتامیک و اسید آسپارتیک قرار دارند زنجیره کناری این دو اسید آمینه به عامل کربوکسیل (COOH) ختم می‌شود. گروه R بسیار قطبی و قابل یونی شدن است بطوری که در PH فیزیولوژیک ، با از دست دادن پروتون ، به آنیون کربوکسیل تبدیل می‌گردد. در این حالت ، اسید آمینه به ترتیب اسید گلوتامیک و اسید آسپارتیک نامیده می‌شوند.
گروه چهارم: اسیدهای آمینه با گروه R قطبی دارای بار مثبت
اسید آمینه لیزین ، آرژینین و هیستیدین در این دسته جای دارند. زنجیره کناری آنها واجد گروه آمین است که در PH خنثی دارای بار خالص مثبت است. لیزین یک عامل آمین در موقعیت کربن شماره 4 زنجیره کناری دارد، آرژینین شامل یک گروه گوآنیدیوم است و هیستیدین گروه یونی شونده ضعیف ایمیدازول دارد. وجود این اسیدهای آمینه در زنجیره پروتئینی تعداد بارهای مثبت روی مولکول را افزایش داده و پروتئین خاصیت قلیایی از خود نشان می‌دهد.
اسیدهای آمینه کمیاب
علاوه بر 20 اسید آمینه ، در برخی از پروتئینها اسیدهای آمینه تغییر شیمیایی یاخته‌ای وجود دارد که از نظر ساختار و فعالیت پروتئینها بسیار مهم‌اند. از مهمترین این تغییرات می‌توان اضافه شدن گروه هیدروکسی به اسید آمینه پرولین (هیدروکسی پرولین) و یا لیزین (هیدروکسی لیزین) ، انواع اسیدهای آمینه استیل‌دار و فسفریل‌دار را نام برد. هیدروکسی پرولین حدود 12% ساختار کلاژن را که یکی از پروتئینهای مهم جانوری است تشکیل می‌دهد همچنین این اسید آمینه در ساختار برخی از پروتئینهای دیواره یاخته‌ای گیاهان وجود دارد که اکستانسین نامیده می‌شود. هیدروکسی لیزین نیز در ساختار کلاژن وجود دارد به همین دلیل کلاژن یکی از پروتئینهای استثنایی در جانوران بشمار می‌آید.


اسیدهای آمینه غیر پروتئینی
افزون بر بیست اسید آمینه اصلی و اسیدهای آمینه کمیاب ، که اساسا در ساختار پپتیدها و پروتئینها وارد می‌شوند، در یاخته‌های بافتهای مختلف اسیدهای آمینه‌ای وجود دارند که در ساختار پروتئینها یافت نمی‌شوند بلکه به صورت آزاد در فرآیندهای متابولیسمی وارد می‌شوند. از مهمترین این اسیدهای آمینه می‌توان از بتا- آلانین که پیش ساز ویتامین اسید پانتوتنیک است، سیترولین و اورنتین ، که ترکیبات حد واسط در سنتز آرژنین در چرخه اوره هستند نام برد. در یاخته قارچها و گیاهان عالی نیز اسیدهای آمینه غیر عادی ، مانند بتا- سیانوآلانین وجود دارد.

قانون بير لامبرت

اساس كار فتومتر بر پاية قانون بير- لامبرت است:
طبق نظر بير، هرگاه يك دسته شعاع نور تكفام P0 از محلولي به غلظتC  عبوركند، كم شدن شدت نور متناسب با غلظت مادة جاذب نور در محلول است.
با توجه به مطالب گفته شده قانون بير- لامبرت به شكل زير بيان مي‎شود:
مقدار نور جذب شده به غلظت مادة رنگي و مسافتي كه نور طي مي‎كند بستگي دارد. هرچه غلظت و مسافت طي شده بيشتر باشد، مقدار نور جذب شده بيشتر خواهد بود. در رابطة فوق، P0 توان تشعشعي ورودي به نمونه، P توان تشعشعي خروجي از نمونه، a ضريب جذب نمونه، كه وابسته به طبيعت مادة جاذب نور و طول موج نوري است، طول مسير پيموده شده توسط نور (طول كووت)، و C غلظت مادة جاذب نور است.

اثر اندازه و شكل ذرات بيولوژيكي بر پراكندگي نور پلاريزه

                      محمد حسيني؛ به راهنمايي: محمدحسين ميران‌بيگي

پراكندگي و يا تفرق نور از ذرات به اندازه، شكل، مواد تشكيل‌دهنده و غلظت آن‌ها بستگي دارد. هنگامي كه نور پلاريزه به مجموعه‌اي از ذرات برخورد مي‌نمايد، معمولا حالت پلاريزاسيون آن تغيير پيدا مي‌كند. با ايجاد حالتهاي مختلف پلاريزاسيون و اعمال آن به ذرات و نيز بررسي تغييرات حاصل شده مي‌توان پارامترهاي فوق را از روي اين نتايج استخراج كرد. ذرات بيولوژيكي طيف وسيعي از ذرات را مي‌پوشانند كه مي‌توانند داراي خواص باقاعده يا همگن و يا بي‌قاعده يا غيرهمگن باشند. در نتيجه يك راه حل رياضي كامل و جامع براي تمامي اين ذرات نمي‌توان ارائه داد بلكه هر ذره با توجه به خصوصيات مستقل خود مورد مطالعه قرار مي‌گيرد. در اين پايان‌نامه، ابتدا تئوري پراكندگي نور از ذرات مورد بررسي قرار مي‌گيرد. سپس با كمك معادلات رياضي موجود شبيه‌سازي براي ذرات باقاعده بعني ذرات كروي و استوانه‌اي با شعاع و ضريب شكست دلخواه صورت مي‌پذيرد با اين فرض كع اندازه ذرات در مجموعه دربرگيرنده ذرات ثابت باشد. سپس بي‌قاعدگي از نظر اندازه و شكل مورد بررسي قرار مي‌گيرد. بي‌قاعدگي از نظر اندازه مربوط به سيستمهايي مي‌گردد كه ابعاد ذرات موجود در سيستم متفاوت از يكديگر بوده و يا اينكه تابع توزيع خاصي را محقق كنند. بي‌قاعدگي از نظر شكل مربوط به سيستمهايي مي‌گردد كه ذرات موجود در سيستم داراي اشكال بي‌قاعده‌اي باشند. نتايج نشان داده‌اند كه شبيه‌سازي پراكندگي نور از ذرات مي‌توان بعنوان ابزار مناسبي جهت پيش‌بيني و تفسير نتايج بدست آم‌ده از اندازه‌گيريهاي آزمايشگاهي ذرات بيولوژيكي بكار رود.