راه تشخیص ویرویید ها

برای تشخیص ویرویید ها بهتر است هم از گیاه ایندیکیتور و هم از پرایمر اختصاصی استفاده شود

تشخيص ، پراكندگي و الگوي الكتروفورزي ويروس تريستزاي مركبات (CTV) در جنوب ايران

وجود ويروس تريستزاي مركبات (Citrus tristeza virus, CTV)، براساس علائم روشني رگبرگ در ليموترش و ساقه آبله‌اي در نارنگيهاي پيوند شده روي ليموترش ، مشاهدهء پيكره‌هاي رشته‌اي خمش‌پذير با الكترون ميكروسكپي عصارهء اين گياهان و آزمايش سرولوژيكي اليزا (DAS-ELISA) در استانهاي فارس و بوشهر به اثبات رسيد. ويروس از بافتهاي درختان نارنگي محلي پيوند شده روي ليموترش كه به طور طبيعي آلوده شده بودند، به وسيلهء دوبار رسوب دادن با پلي‌اتيلن گليكول (PEG) و سپس يك بار سانتريفوژ كردن در ستون داراي شيب چگالي مخلوط سوكروز و سولفات سزيوم، خالص‌سازي شد. آمودهء خالص‌سازي شده داراي طيف جذبي مشابه طيف جذبي نوكلئوپروتئينها بود و مشاهدهء الكترون ميكروسكپي اين آموده وجود پيكره‌هاي رشته‌اي خمش‌پذير را نشان داد. همچنين آزمايش اليزا وجود ويروس تريستزا را در اين آموده اثبات كرد. با تزريق زيرجلدي ويروس خالص شده به خرگوش ، آنتي‌سرمي عليه آن توليد شد. آنتي‌سرم بدست آمده پس از جذب با عصارهء گياه سالم در آزمايش نشت دوطرفه در آگار حاوي SDS فقط در مقابل نمونه‌هاي آلوده به CTV يك خط رسوب تشكيل داد. اين آنتي‌سرم پس از جذب با آمودهء گياه سالم و جداسازي گاماگلوبولين و تهيه آنتي‌بادي متصل به آنزيم در آزمايش DAS-ELISA مورد استفاده قرار گرفت كه در اين آزمايش ، استفاده از رقتهاي 1/900 آنتي‌بادي و 1/300 آنتي‌بادي متصل به آنزيم مناسب تشخيص داده شد. الكتروفورز پروتئين آموده‌هاي خالص‌سازي شده در ژل‌پلي‌اكريل آميد داراي دودسيل سولفات سديم (SDS-PAGE) در مورد تمام جدايه‌ها دو نوع پروتئين نشان داد. يكي از پروتئينها با وزن مولكولي 35500-36300 دالتون در عصارهء گياه سالم نيز مشاهده مي‌شد ولي پروتئيني با وزن مولكولي 22500-23000 دالتون فقط در عصارهء گياهان آلوده وجود داشت . بررسي پوست تنه در قسمت پايه، پوست تنه در قسمت پيوندك ، پوست شاخه‌هاي دوساله، پوست شاخه‌هاي جديد، دمبرگ و آلبيدو ميوهء 11 اصله نارنگي پيوند شده روي ليموترش با روش اليزا نشان داد كه پوست تنه در قسمت پيوندك و پوست شاخه‌هاي دوساله بيشترين مقدار ويروس را دارا هستند. پراكندگي CTV در مناطق مهم مركبات كاري استان‌هاي فارس و بوشهر، بر روي گونه‌ها و رقمهاي مختلف مركبات با استفاده از روش اليزا مورد بررسي قرار گرفت . از 646 درخت مورد آزمايش 242 درخت آلوده تشخيص داده شد. در ميان مناطق مختلف جهرم، خفر، كازرون، فسارود و جنت‌شهر داراب از استان فارس و دالكي، رودفارياب ، خائيز و جم از استان بوشهر و در ميان ارقام مختلف پرتقال، ليموشيرين، ليموترش ، نارنگي محلي، آنشو، نارنگي خاري و نارنگي كلمانتين آلوده تشخيص داده شد. آزمايشهاي انجام شده نشان داد پراكنش CTV در مناطق مختلف و روي رقمهاي مختلف مركبات جنوب ايران نسبتا وسيع است . وجود درختان ليموترش آلوده در نقاط دورافتاده نشان مي‌دهد كه CTV نه تنها احتمالا در سالهاي اخير همراه با رقمهاي جديد مركبات وارد منطقه شده، بلكه ممكن است از زمانهاي خيلي دور نيز در منطقه وجود داشته است . همچنين آلودگي ليموترش امكان وجود ناقل ويروس در منطقهء جنوب كشور را مطرح مي‌سازد. بنابراين آنچه كه لازم است از اين پس مورد مطالعه قرار گيرد علاوه بر پيگيري نقش ناقلين احتمالي، ميزان خسارت ناشي از CTV در درختان مركبات و نوع سويه‌هايي است كه در منطقهء جنوب وجود دارد.

ردیابی بیماری تریستزای مرکبات

در این تحقیق سلامت ارقام مهم تجاری منبع پیوندک و ارقام وارداتی در ایستگاه های مرکبات رامسر(60 مورد)، خرم آباد تنکابن(35 مورد)،  کترا(حدود 300 مورد) و تمامی نهالهای مادری وارداتی از کشور فرانسه از نظر بیماری تریستزا با روش ایمیونوپرینتینگ و الایزا مورد بررسی قرار گرفتند. بدین صورت که در فصل گل، جمع آوری گلهای بسته از چهار جانب درختان مورد نظر انجام شد. گلبرگهای گل جدا شده و لکه گذاری کاغذهای نیتروسلولز به منظور انجام آزمون ایمیونوپرینتینگ با استفاده از برش مقطع تخمدان صورت گرفت. دو خانه از میان جدول ترسیم شده روی کاغذها برای هر نمونه در نظر گرفته شده و در هر یک از دو خانه 4-3 لکه ایجاد شد. همچنین دو خانه برای شاهد مثبت و یک خانه برای شاهد منفی در نظر گرفته شد. این کاغذها  در شرایط آزمایشگاه به مدت دو ساعت در معرض محلول 1% آلبومین گاوی قرار گرفته و پس از سه بار شستشو، سه ساعث در آنتی بادی نشاندار ویروس مربوطه غوطه ور و مجددا شسته شدند. مدتی پس ازاضافه کردن سوبسترای NBT-BCIP  بقایای رنگ رسوب ارغوانی در ناحیه آوندی نقوش مربوط به شاهد مثبت و نمونه های آلوده به ویروس ظاهر شد و در نمونه های سالم واکنش تغییر رنگ مشاهده نشد. آزمون الایزا برای تائید موارد مشکوک در ایمیونوپرینتینگ یا به عنوان روش جایگزین مورد استفاده قرار گرفت.

     پس ازاضافه کردن سوبسترای NBT-BCIP  بقایای رنگ رسوب ارغوانی در ناحیه آوندی نقوش مربوط به شاهد مثبت( لایم آلوده موجود در گلخانه موسسه) ظاهر شد و در نمونه های سالم واکنش تغییر رنگ مشاهده نشد.نتایج مشابه در آزمون الایزا حاصل شد. در بین درختان مادری و نهالهای وارداتی از فرانسه تست شده با آنتی بادی بیوربا هیچ کدام به ویروس تریستزای مرکبات آلوده نبودند. در ضمن  با بررسی­های به عمل آمده مشخص شد که می توان از تخمدان گل در ردیابی ویروس تریستزای مرکبات در آزمون ایمیونوپرینتینگ و الایزا  استفاده نمود.

                                           

خالص‌سازي، توليد آنتي‌سرم و توسعه يك سيستم بيوتكنولوژيكي حساس به منظور تشخيص دقيق و سريع ويروس تريست

يك گياه مركبات با علائم مشكوك به ويروس تريستزا در باغات مهدشت ساري انتخاب و وجود ويروس مزبور در آن به روش Indexing به اثبات رسيد. گياه مزبوربعنوان منبع اوليه ويروس انتخاب و از آن پيوندك آلوده تهيه گرديد. بمنظور تكثير ويروس ، پيوندكهاي مزبور به 150 اصله نهال ليمو آب پيوند زده شد و نهالها در گلخانه نگهداري گرديدند، تك‌تك نهالها از نظر بيماريهاي ويروسي و شبه ويروسي ديگر از جمله Exocortis، پسورز و نقش حلقوي به روش متداول Indexing مورد آزمايش قرار گرفتند و معلوم شد كه نهالهاي مورد نظر فقط آلوده به ويروس تريستزا هستند و در گياهان محكي كه مورد استفاده قرار گرفته بودند هيچگونه علائم آلودگي ديگر مشاهده نگرديد، در آينده بافت آلوده نهالهاي پيوند زده شده، بمنظور خالص‌سازي ويروس مورد استفاده قرار خواهند گرفت .

میزبان زمستانه ویروس cmv فرفیون

درخت سالم- درخت آلوده به ویروس تریستزا در ساری

روش تولید گیاهان سالم با پیوند نوک مریستم

مرکبات یکی از مهمترین میوه های گرمسیری و  نیمه گرمسیری جهان است که به دلیل طعم دلپذیر و خواص فراوان غذایی و بهداشتی، از محبوبیت خاصی برخوردار است.  كاهش رشد، عملكرد وكيفيت ميوه، محدوديت دراستفاده از پايه ها ، توقف باردهي درختان و نهايتاً زوال آنها كه ناشي از بيماريهاي ويروسي و شبه ويروسي است زيانهاي اقتصادي فراواني درباغهای مركبات دنيا ايجاد نموده است. به عنوان مثال فقط بيماري ويروسي تريستزا به تنهايي ميليونها اصله درخت مرکبات را طي سالهای گذشته از بين برده است. دروضعيت فعلي دركشورايران، جهت توليد نهال مركبات از درختان منطقه استفاده مي گردد كه به دليل وجود ناقلين و همچنين انتقال عوامل بيماريزاي ويروسي و شبه ويروسي از طريق پيوندك، احتمال آلودگي نهالهاي توليدي وجود دارد بنابراين ازبين بردن كانون آلودگي و ايجاد باغ پيوندك سالم كه هرساله ازلحاظ عدم آلودگي به بيماريهاي شايع درمنطقه آزمایش گردد بسيار حائز اهميت بوده و تكنيك STG  مي تواند دراين زمينه كمك مؤثري باشد.

 

     در حال حاضرموثرترین روش تولید گیاهان سالم، پیوند نوک مریستم يا  STG میباشد. مطالعات علمی نشان داده با استفاده از این روش بيماريهاي تريستزا، اگزوكورتيس، استابورن وكاچكسيا حذف شده و تقريباً 100 درصد گياهان توليدي عاري از اين بيماريها هستند. گسترده ترين برنامه هاي سالم سازی درکشورهای صاحب نام تولید کننده مرکبات برمبناي STG صورت گرفته و میلیونها درخت سالم ازاين طريق توليد ودرباغات اين كشورها كشت گرديده است. تكنيك STG علاوه برسالم سازي، در قرنطينه ارقام وارداتي و ممانعت از ورود عوامل بيماريزاي ويروسي و شبه ويروسي نیزكاربرد دارد. علاوه برآن نهالهاي توليدي با روش STG ويژگيهاي نونهالي نداشته و معمولاً دوسال بعد از پيوند، تشكيل گل و ميوه مي دهند. در این تحقیق بدنبال تولید نهال سالم ارقام تجاری موجود و افزایش ضریب سلامت ارقام وارداتی آنچه مسلم است کاربرد این روش در کنترل عوامل محدود کننده نقش مهمی را در توسعه پایدار و خود کفایی کشور خواهد داشت.

نتایج و دستاوردهای علمی طرح:

بومی سازی اجرای این تکنیک با ایجاد تغییراتی در روش استاندارد جهانی

اهش هزینه های تولید نهال سالم

امکان کاربرد این روش در سالم سازی سایر درختان میوه

كارايي تكنيك پيوند نوك شاخه در توليد پرتقال و اشنگتن ناول عاري از ويروس تريستزا

        علي جعفري مفيد آبادي ، الهه زرين بال ، وحيد اعتماد ، شمس ا... شريعت نژاد  

در اين مطالعه كه به منظور توليد نهال عاري از ويروس تريستزا در پرتقال رقم واشنگتن ناول انجام شد از آزمايش فاكتوريل در قالب طرح كاملا تصادفي با چهار تيمار، چهار تكرار و ده گياهچه به عنوان واحد آزمايشي استفاده گرديد. براي اجراي آن، بافت مريستم نوك شاخه پرتقال واشنگتن ناول آلوده به ويروس به همراه دو آغازه برگي به طول دو دهم تا چهار دهم ميلي متر از آن جدا شده و روي اپي كوتيل سربرداري شده گياهچه هاي تروير سيترنج و سيتروملو پرورش يافته در محيط كشت مصنوعي، زماني كه سه تا پنج سانتي متر طول داشتند به دو روش تي معكوس و مماس با لايه زاينده آوندي گياهچه پايه كه قبلا سربرداي شده بود پيوند گرديد. گياهان پيوندي پس از انتقال به محيط كشت مايع در اطاقك رشد با دماي ثابت 27 درجه سانتي گراد و دوره روشنايي 16 ساعت با شدت 1000-5000 لوكس استقرار يافتند. بعد از گيرايي پيوند، زماني كه پيوندك داراي دو برگ نمو يافته بود به تركيب خاكي مناسب منتقل شدند. جهت بررسي آلودگي گياهان حاصله، از گياه محك و آزمون سرولوژيكي الايزا استفاده گرديد و كليه گياهچه هاي پيوندي عاري از ويروس تريستزا بودند. نتايج حاصله نشان داد كه قرار دادن نوك شاخه در شكاف تي معكوس موفقيت بيشتري در گيرايي پيوند داشته همچنين بين پايه هاي مورد استفاده اختلاف معني دار مشاهده نگرديد.

خالص‌سازي توليد آنتي‌سرم و توسعه يك معرف بيوتكنولوژيكي حساس به منظور تشخيص دقيق و سريع ويروس تريستزا

يك گياه مركبات با علائم مشكوك به ويروس تريستزا در باغات مهدشت ساري انتخاب و وجود ويروس مزبور در آن به روش Indexing به اثبات رسيد. گياه مزبور به عنوان منبع اوليه ويروس . ource of inoculum` انتخاب و از آن پيوندك آلوده تهيه گرديد. به منظور تكثير ويروس ، پيوندكهاي مزبور به 150 اصله نهال ليمو آب پيوندك زده شد و نهالها در گلخانه نگهداري گرديدند. تك‌تك نهالها از نظر بيماريهاي ويروسي ديگر از جمله Exocotrtis، پسوروز و نقش حلقوي به روش متداول Indexing مورد آزمايش قرار گرفتند و معلوم شد كه نهالهاي مورد نظر فقط آلوده به ويروس تريستزا هستند و در گياهان محلي كه مورد استفاده قرار گرفته بودند هيچگونه علائم آلودگي ديگر مشاهده نگرديد. در آينده بافت آلوده نهالهاي پيوند زده شده به منظور خالص‌سازي ويروس مورد استفاده قرار خواهند گرفت .

اثبات ويروسي بودن بيماري گياهان

                                           مینا عظیمی پور

براي اثبات ويروسي بودن بيماري گياهان ابتدا بايد ثابت شود كه ميكروارگانيسنهاي ديگر در بروز آن نقش ندارند.

براي اينكار از روش هاي مختلف شناسايي استفاده مي شود:

Symptomatology -

- خواص مرفولوژيكي ميكروارگانيسم

- خواص فيزيكوشيميايي

- تستهاي serology : در اين روش يك ويروس مشخص با آنتي ژن با هم تركيب ميشود و عصاره گياه را در حضور آنتي سرم همان ويروس قرار مي دهند.در صورت رنگي شدن آنتي ژن ويروس قابل شناسايي است.

در روش ELISA كه از متداولترين روشهاي سرولوژي است در جهت تشخيص ويروسها و باكتريهاي گياهي و حيواني مورد استفاده قرار مي گيرد.

ELISA  براي كشف هر جسمي كه آنتي ژنيك است استفاده مي شود.

در اين روش بطور غير مستقيم آنتي ژن بطور مستقيم با آنتي بادي متصل شده به آنزيم در تماس نخواهد بود و بين اين دو آنتي بادي قرار مي گيرد.

روش وسترن بلات تاييدي براي اليزاست.

آآزمايشات ته نشيني اغلب در كشف ويروسها , باكتريها , اسپيروپلاسماها بكار برده مي شود ولي براي شناخت موارد شيميايي كاربرد زيادي ندارد.

- در روش PCR   كه براي كارهاي مولكولي استفاده مي شود ابتدا RNA  يا DNA ويروس و باكتري را استخراج كرده پس با استفاده از آنزيم پليمراز  آنرا تكثير مي كنيم .در اين روش با حجم كم نمونه مي توان آزمايش را انجام داد.

 

بیماری های ویروسی و شبه ویروسی مو

                                                  سیما مقصودلو

در

در ابتدا ویروس در یک گیاه چند سالۀ چوبی مانند مو به مفهومبیماری قابل انتقالی بود که عامل مشهودی برای آن نمی دانست کشف شود . ویروس و بیماری به یک مفهوم به کار می رفت . بیماری قابل انتقال بود و عامل آن غیر قابل رویت . بیماری با اندامهای تکثیری گیاه ( قلمه های ریشه دار ، نهالهای تهیه شده از راه خواباندن ، جوانه ها ، پیوندکها و غیره )، ناقلان بی مهره (معمولاً حشرات)، یا از راه مایه زنی عصاره گیاه به گیاهان جدید و یا نباتات سالم موجود در جمعیت گیاهی انتقال پیدا می کرد . عامل مولد بیماری با روشهای معمولی جداسازی قابل تشخیص نبود و با بهترین میکروسکپهای نوری هیچ موجود زنده ای در انساج آلودۀ گیاه پیدا نمی شد .

انتقال از راه پیوند زدن ، قلمۀ ریشه دار ، یا پیوند جوانه در آن زمان یکی از خصوصیات عمده ویروسها در گیاهان چند ساله به شمار می رفت که هنوز هم اهمیت دارد . نقش حشرات و مخصوصاً نماتدها به عنوان ناقل بیماری به اثبات رسید ولی شیرۀ پرورده در انتشار ویروسها در گیاهان چند ساله اهمیتی نداشت .

با کشف و تکامل میکروسکوپ الکترونی ، ذرات بسیار ریزی در گیاهان بیمار یافت شد . جداسازی و تعیین صفات بیوشیمیایی این ذرات کوچک ، مفهوم ویروس را دگرگون ساخت. در مفهوم و معنای جدید ، به این ذرات ویروس اطلاق شد .

در بیماری شناسی گیاهی ، رعایت اصول کخ برای اثبات این موضوع که یک میکروارگانیسم عامل بیماری است ، ضرورت دارد . اعمال این آزمایش ها در مورد ویروسها در گیاهان چند ساله ، مانند مو ، مشکل است . اگر ثابت شود که یک ذره ویروس خالص مولد بیماری است ، در این صورت آن را بیماری ویروسی می گویند . چنانچه در یک بیماری ، جداسازی پیکره و اثبات بیماریزایی آن مقدور نشود آن را بیماری شبه ویروسی گویند . اثبات بیماریزایی ویروسها در گیاهان چوبی مشکل است ، زیرا ویروسها جزء عوامل بیماریزای اجباری هستند و بیماریزایی خود را به هنگام خالص سازی از دست می دهند . عامل بیماری پیچیده شدن برگ که یکی از بیماری های بسیا مهم شبه ویروسی مو است هنوز هم به روشنی مشخص نشده است .

 

جهت مطالعه  ۵ صفحه ادامه مطلب ایمیل بزنید

Maize Dwarf Mosaic Virus

تعيين ترادف و خصوصيات مولکولي ويروس موزائيک ايراني ذرت

امير مساح¹، کرامت اله ايزدپناه¹، عليرضا افشاريفر¹، استفان وينتر² و علي آهون منش³

1-مرکز تحقيقات ويروس شناسي گياهي، دانشکده کشاورزي، دانشگاه شيراز 2-بخش ويروس شناسي گياهي، برانشويگ، آلمان 3- دانشگاه صنعتي اصفهان

 

از روش واکنش زنجيره اي پلي مراز با آغازگرهاي تصادفي  (random-PCR)و سپس اتصال قطعات تعيين ترادف شده جدا از هم از طريق طراحي آغازگرهاي اختصاصي، براي تعيين ترادف ويروس موزائيک ايراني ذرت (IMMV) استفاده شد. بدين ترتيب ترادف کامل ژن ها و نواحي بين ژني و ترادف ناقص نواحي دو ناحيه ابتدائي  (trailer) و دنباله (leader) شامل 12381 نوكلئوتيد بدست آمد و مورد تجزيه و تحليل قرار گرفت. اين مطالعه نشان داد که IMMV شامل شش ژن بر روي رشته مكمل ويروسي مي باشد. هر ژن از اولين متيونين تا كدون خاتمه بين دو ناحيه بين ژني محاسبه شد. نقشه پيشنهادي ژنومي اين ويروس بصورت                ¢ 5 l-N-P-3-M-G-L-t ¢3  مي باشد. N، P، 3، M، G و L بترتيب ژن هاي نوكلئوكپسيد، فسفوپروتئين، پروتئيني با نقش نامشخص، ماتريكس پروتئين، گليكوپروتئين و ترانس كريپتاز مي باشند. l و t بترتيب نواحي leader و trailer مي باشند. ژن ها در ويروس موزائيك ايراني ذرت بوسيله نواحي بين ژني كه بسيار حفاظت شده مي باشند از يكديگر جدا مي شوند. ترادف استنتاجي(consensus) براي نواحي بين ژني حفاظت شده بصورت¢5¢AAUUCUUUUUGGGUUU/G3 مي باشد. همرديف سازي دوتائي و  چندتائي و تجزيه و تحليل درخت فيلوژنتيك نشان داد كه  ويروس موزائيك ايراني ذرت در مقايسه با ساير رابدوويروس هاي گياهي به ويروس موزائيك ذرت   (MMV)نزديكتر است. نتايج حاصل از اين تحقيق شامل تجزيه و تحليل ترادف همسو با نتايج حاصل از كارهاي قبلي شامل فقدان ارتباط سرولوژيكي بين  ويروس موزائيك ايراني ذرت و ويروس موزائيك  ذرت، اختلاف در دامنه ميزباني، اختلاف در اندازه پروتئين ها، اختلاف در اندازه پيکره هاي ويروسي و داشتن ناقل هاي مختلف نشان مي دهد كه ويروس موزائيك ايراني ذرت يك ويروس مشخص و جدا مي باشد. ولي نزديكترين ويروس به آن ويروس موزائيك ذرت مي باشد.

 

 

Sequencing and molecular characterization of Iranian maize mosaic nucleorhabdovirus

 

A. Massah¹, K. Izadpanah¹, A. R. Afsharifar¹, S. Winter² and A. Ahoonmanesh³

1- Plant Virus Research Center, College of Agriculture, Shiraz University, Shiraz, Iran 2- DSMZ Plant Virus Division, Braunschweig, Germany 3- Isfahan University of Technology

 

Random polymerase chain reaction (rPCR) followed by filling of gaps by the use of specific primers (designed from the rPCR data) was used to sequence and subsequently analyze the genome of   Iranian maize mosaic virus (IMMV). Complete nucleotide sequence of genes and intergenic regions and partial sequence of leader and trailer regions comprising 12381 nucleotides were determined. Based on these data IMMV had six open reading frames (ORF) on complementary viral RNA (vcRNA). All ORFs were estimated as a region from the first methionine to a stop codon between two junctions. The proposed IMMV genomic map is 3¢ l-N-P-3-M-G-L-t 5¢. N, P, 3, M, G and L are genes for proposed nucleocapsid, phosphoprotein, a protein of unknown function, matrix protein, glycoprotein and transcriptase. T and l are the trailer and the leader sequences, respectively.  Each ORF in IMMV is bordered by two intergenic regions. Part of all intergenic regions is highly conserved. The consensus sequence for conserved intergenic regions is 3¢AAUUCUUUUUGGGUUU/G 5¢. Pairwise and multiple alignments and phylogenetic tree analysis showed IMMV closer to MMV than to other plant rhabdoviruses. The results of this study, including sequence analysis in agreement with the results of previous works including absence of serological relationship between IMMV and maize mosaic virus (MMV), difference in host range, difference in size of proteins, difference in particles size and transmission by different vectors show that IMMV is a distinct virus in the genus Nucleorhabdovirus. However, the closest virus to IMMV appears to be MMV.

بررسي علايم ويروس پژمردگي لکه اي گوجه فرنگي

 

اسماعيلي فر افشين,زاد سيدجواد,مصاحبي غلام حسين,محمدي مجتبي,اخوت سيدمحمود

تابستان 1375 تعداد فراواني نمونه از مزارع گوجه فرنگي مناطق ورامين، کرج، ملارد، شهريار، هشتگرد، قزوين جمع آوري گرديد. درآزمون انتقال ويروس، اطلسي و انواع توتونها بعنوان گياهان محک مايه کوبي شدند. بعد از گذشت دو تا چهار روز از مايه کوبي بر روي برگهاي اطلسي، لکه هاي نکروتيک موضعي برنگ قهوه اي مشاهده شد. در توتونها، هفت الي ده روز بعد از مايه کوبي لکه هاي نکروتيک موضعي ظاهر شده و بدنبال آن تا دو هفته بعد از مايه کوبي علايم سيستميک شامل لکه هاي حلقوي و متحدالمرکز روي برگها، نکروز ساقه و پژمردگي گياه مشاهده گرديد، متعاقب آن اضمحلال کامل گياه اتفاق افتاد. در پرپاراسيونهاي ميکروسکوپ الکتروني تهيه شده با آنتي سرم ويروس، پيکره هاي گرد و کروي شکل ويروس به ضخامت 70-120 ننومتر مشاهده شد. با توجه به نتايج بدست آمده آلودگي به "ويروس پژمردگي لکه اي گوجه فرنگي" در مزارع گوجه فرنگي ورامين وجود دارد .

آخرین بازدید ها

آمار کشور بازديدکننده ها
رتبه	کشور	تعداد ورودی	درصد	نمودار
1	ج. ا. ايران	8963	64.08%
2	انگلستان	4528	32.37%
3	آمريکا	153	1.09%
4	امارات	40	0.28%
5	کويت	38	0.27%
6	آلمان	24	0.17%
7	هلند	18	0.12%
8	کانادا	18	0.12%
9	ترکيه	16	0.11%
10	سوئد	15	0.1%
11	هند	14	0.1%
12	فرانسه	13	0.09%
13	مکزيک	9	0.06%
14	يونان	8	0.05%
15	عربستان	7	0.05%
16	فيليپين	7	0.05%
17	افغانستان	6	0.04%
18	مالزي	6	0.04%
19	مجارستان	5	0.03%
20	اسپانيا	5	0.03%
21	چين	5	0.03%
22	برزيل	5	0.03%
23	پرو	5	0.03%
24	بلژيک	4	0.02%
25	استرالیا	4	0.02%
26	ايتاليا	4	0.02%
27	ژاپن	4	0.02%
28	تايلند	4	0.02%
29	اندونزی	4	0.02%

بیماری ویروسی پیچیدگی و تورم رگبرگ های چغندرقند

                         محمدناصر ارجمند-ولی اله غدیری -کریم فارسی نژاد

بیماری ویروسی پیچیدگی و تورم رگبرگ های چغندرقند یکی از بیماریهای مهم چغندرقند است که در شرایط مناسب می تواند باعث نابودی زراعت چغندرقند شود.ناقل این بیماری، یک نوع زنجره است که ویروس عامل بیماری را از بوته های آلوده به بوته های سالم منتقل می کند. این بیماری از بیشتر مناطق چغندرکاری کشور گزارش شده ولی در مناطق فارس، اصفهان و کرمان از اهمیت اقتصادی برخوردار است. علایم بیماری در بوته های آلوده ابتدا از برگ های جوان مرکزی، از لبه های پایین آنها شروع می شود و به تدریج با رشد گیاه تمام برگ ها آلوده شده و علایم بیماری را نشان می دهند. برگ های بوته های آلوده به بیماری از قسمت پایین به طرف بالا شروع به پیچیدن می کنند به طوری که در بعضی از بوته های به شدت آلوده برگ ها به طور کامل به سمت داخل لوله می شوند. شفافیت تورم رگبرگ های فرعی و به وجود آمدن خارهایی به اندازه یک تا 2 میلی متر بر روی آنها از علایم مشخصه بیماری است (شکل 1 و 2). برگ های بوته آلوده به رنگ سبز تیره، کدر، صخیم، شکننده و چین خورده هستند. ترشح قطرات چسبنده و شفاف از دمبرگ و رگبرگ اصلی در سطح زیرین برگ بوته های آلوده نشان دهنده شدت حمله بیماری می باشد این قطره های شفاف به تدریج قهوه ای و سیاه رنگ می شوند.

ریشه بوته های آلوده کوچک مانده و در برش عرضی آنها حلقه های هم مرکز تیره رنگ دیده می شود و در برش طولی این حلقه ها به صورت نوارهایی ظاهر می شوند که در فاصله، بخش های روشن قرار دارند. ویروس عامل بیماری دو گونه زنجره منتقل می شود. تغذیه زنجره ها از شیره گیاهی بوته های آلوده باعث می شود که ویروس به داخل دستگاه گوارش زنجره وارد شود و در هنگام تغذیه از بوته های سالم ویروس از طریق خرطوم حشره به داخل بافت گیاه سالم تزریق شود و آن را آلوده کند. چنان که گیاه در مرحله کوتیله دونی (دو برگ اولیه پس از سبز شدن) به وسیله زنجره ناقل ویروس آلوده شود و از طرف دیگر ویروس حاد و رقم چغندرقند حساس باشد بوته های جوان خشکیده و از بین می روند. آلودگی بوته چغندرقند در مراحل بعد سبب می شود که بوته ها کم رشد و کوتاه باقی بمانند. این بیماری تا 90% از مزارع چغندرقند استان فارس را آلوده می سازد. ویروس کرلی تاپ میزبان های متعددی دارد و بیش از 300 گونه گیاهی از 24 خانواده را شامل می شود. در بین گیاهان زراعی، گوجه فرنگی، بادمجان، هندوانه، طالبی و لوبیا از علف های هرز، آتریپلکس (شوره)، علف شور، سلمه، تره، پونه درمنه، علف هفت بند کاردی و گاو زبان از مهم ترین میزبان ها و پناهگاه زنجره ناقل آن می باشد.

روش های جلوگیری از خسارت بیماری کرلی تاپ :

1- زودکاشتن چغندرقند به منظور اجتناب از آلودگی بوته ها در مرحله گیاهچه ای

2- استفاده از حشره کش های مناسب برای کنترل زنجره ها در مزارع چغندرقند و نیز در کانون های طبیعی فعالیت و تکثیر حشره

3- ضدعفونی بذر با سموم سیستمیک جدید : این روش برای حفظ گیاهچه از حمله زنجره ها در اوایل دوره رشد بوته موثر است.

4- استفاده از رقم های مقاوم به بیماری : انتخاب و کاشت رقم هایی که در مقابل این بیماری از خود مقاومت نشان می دهند، از اهمیت ویژه ای برخوردار است. به همین علت موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه بذر چغندرقند رقم H5505 را معرفی و نسبت به تولید بذر و توزیع آن در مناطق آلوده اقدام نموده است. علاوه بر آن اصلاح رقم های مقاوم را نیز در رأس برنامه های اصلاحی خود قرار داده است. با توجه به نکاتی که در بالا به آنها اشاره شد مبارزه تلفیقی یعنی استفاده از روش های مبارزه زراعی، شیمیایی و استفاده از رقم های مقاوم مجموعاٌ می توانند از خسارت این بیماری جلوگیری نمایند.

beet curly top virus

epinasty   
abnormal, downward curling of a leaf, leaf part, or stem
(beet curly top virus effects in tumble mustard, Sisymbrium altissimum)

وضعيت شش ويروس مهم بيماري زا در مزارع سيب زميني استان خوزستان

                          رضا خاك ور ، مسعود شمس بخش ، رضا پوررحيم

به منظور شناسايي و تعيين فراواني بيماري هاي ويروسي مهم مزارع سيب زميني استان خوزستان در طول فصول زراعي سال 78-1377 از مناطق مختلف استان مزبور به طور تصادفي نمونه برداري شد. نمونه هاي جمع آوري شده با استفاده از آزمون سرولوژيكي الايزا (ELISA) و روش هاي گلخانه اي مورد بررسي قرار گرفتند. نتايج اين تحقيق نشان داد كه هر شش ويروس (PVY)Y، 68 درصد به ويروس (PVS) S، 44 درصد به ويروس (PVX) X، 25 درصد به ويروس پيچيدگي برگ (PLRV)، 22 درصد به ويروس (PVM) M و 11.5 درصد به ويروس موزاييك يونجه (AMV) آلوده بودند. به منظور تعيين سويه هاي سه ويروس PVY، PVX و AMV از نمونه هايي كه براساس نتايج آزمون الايزا فقط به يك ويروس آلوده بودند، تعداد 25 جدايه PVY، هفت جدايه PVX و سه جدايه AMV انتخاب و با استفاده از گياهان معرف مناسب از لحاظ زيستي خالص گرديدند. براساس نتايج واكنش گياهان معرف و اختلاف در قدرت انتقال جدايه هاي مختلف ويروس توسط شته، 25 جدايه PVY متعلق به سه گروه نژادي PVYO، PVYN و PVYC بودند. همين مطالعات در مورد هفت جدايه ويروس PVX نشان داد كه به غير از يك جدايه كه داراي علايم متفاوت در روي گياهان سلمه سفيد (Chenopodium album L.) و سلمه تره (Chenopodium quinoa Wild) بود، همگي از لحاظ زيستي مشابه هستند.
مطالعات مشابه در مورد سه جدايه ويروس موزاييك يونجه (AMV) نيز نشان داد كه هر سه جدايه داراي خصوصيات يكسان و متعلق به نژاد كاليكو (Calico) هستند. اين جدايه هاي AMV از لحاظ زيستي به دو گروه تقسيم شدند: يك گروه در روي گياه لوبيا (Phaseolus vulgaris L.) و لوبيا چشم بلبلي (Vigna unguiculata L.) علايم سيستميك توليد كردند در حاليكه گروه دوم فقط توانستند روي اين گياهان لكه موضعي ايجاد نمايند.

بررسي مقاومت لاين هاي تراژن توتون Nicotiana tabacum cv. Samsun در برابر سه جدايه ايراني ويروس Y سيب

       رضا پوررحيم ، علي آهون منش ، هاله هاشمي ، سيروس زينلي ، شيرين فرزاد فر  

در اين بررسي ژن پروتئين پوششي نژاد نكروتيك ويروس واي سيب زميني (PVY-CP) در حامل pBIN19 همسانه سازي گرديد. به كمك طراحي آغازگر، اين ژن به نحوي همسانه سازي شد كه فاقد كدون شروع باشد. گياهان توتون Nicotiana tabacum cv. Samsun به روش قطعه برگي و با استفاده از باكتري tumefacience Agrobanterium توسط ژن PVY-CP، تراژن گرديدند. مقاومت لاين هاي تراژن Nicotiana tabacum cv. Samsun حاوي ژن الحاقي PVY-CP، در برابر واگيرش سه جدايه ويروس واي سيب زميني شايع در ايران شامل PVYn-Mz، PVYn-H و PVYo-Ar مورد ارزيابي قرار گرفت. براساس خصوصيات بيولوژيكي، سرولوژيكي و نقشه تحديد ژن پروتئين پوششي، جدايه هاي PVYn-Mz، PVYn-H با نژاد نكروتيك PVY و جدايه PVYo-Ar با نژاد معمولي PVY مشابهت داشتند. حضور ژن PVY-CP الحاقي به ژنوم گياه، در 29 لاين از 31 لاين مقاوم به كانامايسين، به وسيله واكنش زنجيره اي پليمراز مورد تاييد قرار گرفت. نتايج ارزيابي نشانه هاي بيماري و آزمون اليزا نشان داد كه در مايه زني جدايه PVYn-H، 5 لاين مقاوم، 9 لاين داراي نشانه هاي ملايم بيماري و 17 لاين حساس و در برابر مايه زني جدايه PVYn-Mz، 4 لاين مقاوم، 10 لاين با نشانه هاي ملايم بيماري و 17 لاين حساس و در برابر مايه زني جدايه PVYo-Ar دو لاين با نشانه هاي ملايم و 29 لاين حساس بودند. با توجه به فقدان كدون شروع در تراژن PVY-CP، هيچ محصول پروتئيني حاصل از ترجمه تراژن در لاين هاي مقاوم، رديابي نگرديد. در اين اساس به نظر مي رسد كه در اين گياهان، مقاومت با منشا آر.ان.اي (RNA mediated resistance-RMR) مطرح باشد. مكانيسم (هاي) احتمالي مطرح در چنين مقاومتي مورد بحث قرار گرفته است. با توجه به محدود بودن منابع مقاومت طبيعي در بين گياهان متعلق به جنس Nicotiana، دست يابي به منابع مقاومت مهندسي شده مفيد مي باشد.

بیماری رایزومای چغندر قند

                                                      مصطفی عابدی

ريزومانيا يكي از مخربترين و پرخسارت‌ترين بيماريهاي مهم چغندرقند مي باشد كه در مناطـق مختلف كشور بويژه مناطق مغان ، اصفهان و خراسان  وجود  دارد . بيماري ريزومانياي چغندرقند كه بخـــاطرعلا مت بيماري (پرمويي و ريش بزي شدن) در دو طرف ريشه اصلي به ديوانگـــــــي ريشه موسوم است ، بوسيله ويروس ( ويروس زردي نكروتيك رگبرگ چغندرقند) كه با قــــــارچ خــــاكزي  Polymyxa  betae   منتقل مي‌شود، حـــــادث مي گردد و به جهت كوتوله شدن ريشـه و ادامه رشد ريشه در قسمت سطحي خاك محصول برداشتي خيلي كم ميشود و شديداً عملــكرد گیاه در هكتاركاهش مي يابد

. اين ويروس بوسيله قارچ پلي ميكسا بتائه منتقل ميشود ، اين قــارچ در بافت زنده ميزبان قادر به توليد مثل است ، قارچ مذكور خاكـــزي بوده وحـامل ويروس عامل بيماري است از ميزبا نهاي ديگر قارچ مذكـور اعضاي خانواده هاي اسفناجيان و تاج خروس بصورت محدود است و ويروس مذكور از طريق مكانيكي به گونه هاي ميزبان منتقل ميشود .  

 

كنترل بيماري :

     

  اسپورهاي استراحتي پلي ميكسا بتائه مي توانند در خاك‌هاي آلوده براي مدت 10 سال به زندگي ادامه دهند ، بنابراين به محض ورود ويروس به اراضي كشاورزي جلوگيري از آلودگــــــي از طريق روش هاي زراعي يا شيميايي تقريباً غير ممكن است .

به هر صورت از اقدامـات اساسي زير جهت كنترل و كاهش بيماري با رعايت اصولي و صحيح مي توان تا حد ريشه كن كردن بيماري و فراتر ازكنترل ، گام برداشت و بهره جست و تا حد امــــــكان مانع از گسترش آلودگي به مزارع سالم گرديد .

1-     عدم كشت چغندرقند در مناطق آلوده حداقل تا 5 سال(پرهيز از تناوب تكراري)

2-     استفاده از ارقام مقاوم و متحمل به بيماري مذكور

3-     عدم انتقال خاك و چغندرهاي آلوده به مزارع سالم

4-     كشت زود هنگام (خنكي خاك هنوز موجود باشد) تا امكان الگوي كشت

5-     مديريت صحيح آبياري اوايل فصل زراعي (شش هفته اول) عدم ماندآبي

6-     اعمال مديريت صحيح در كود دهي و استرس آبي

7-     كنترل هرزآب  مزارع(جهت جلوگيري از آلودگي مجدد و عدم انتشار اسپورهاي عامل آلودگي به مزارع سالم)

8-     بهبود زهكشي مزارع با انجام شخم عميق و زير شكني لايه هاي سخت

9-     جلوگيري از كوبيدگي و فرسايش خاك (كوبيدگي زهكشي را كاهش مي دهدو فرسايش بادي خطر انتشار بيماري را افزايش ميدهد).

10-  رعايت بهداشت كنترل آلودگي در استفاده از ادوات كشاورزي(ضد عفوني و شتشو با مواد شوينده)

11-  رعايت قرنطينه بذور وارداتي و رعايت كنترل ايزولاسيون مزارع آلوده

12-  كنترل جابجايي گله هاي گاو و گوسفنددر بين مزارع آلوده به مزارع سالم

13-  تميز نمودن خاك همراه (لاستيك و ساير قسمتهاي تراكتورو ماشينهاي خاك ورزي و ماشين آلات برداشت)

14-  استفاده از پوتين و چكمه پلاستيكي در بازديد از مزارع آلوده(ضدعفوني آنها و در صورت شدت آلودگي سوزاندن آنها)

15-  استفاده از مواد ضدعفوني خاك مثل Telone II . (مقرون به صرفه اقتصادي نيست)

16-  پرهيز از عمليات زراعي غير ضروري در مزرعه(جهت كاهش پخش و گسترش عامل بيماري)

17-  استفاده از آب گرم بعلاوه صابون ، تحت فشار جهت پاكسازي و تميز نمودن ادوات كشاورزي و وسايل حمل و نقل

            

تريستيزاي مركبات(بيماري غم) Citruc Tristeza

                                                   علی درویش زاده

به معني غم و اندوه است. اين بيماري اولين بار در اواخر سال 1890 در آفريقاي جنوبي مشاهده شده است. در ابتدا تصور مي‌شد كه علت ناسازگاري بين پايه و پيوندك است. در ايرن بيماري در سال 1355 در ساري روي نارنگي ساتسوما satsuma مشاهده شده است. تريستيزا به انواع مركبات حمله مي‌كند. پايه‌هاي نارنگي و پرتقال حساسند و پايه‌هاي نارنج و لمون بسيار حساسند. روي پايه سلطان مركبات، توسرخ مرگ ناگهاني ايجاد مي‌كند.

عامل ويروس رشته‌اي به ابعاد 2000×12 نانومتر از گروه Closterovirus كه با شته انتقال مي‌يابد و داراي گسترش جهاني است. علائم تيپيك در درختان پيوند خورده با پايه‌هاي حساس بصورت زوال(decline) سريع يا مزمن بروز مي‌نمايد. اما در درختان پيوند نخورده زردي ظاهر مي‌شود. در درختان جوان گل دهي به ميزان بالايي است. در درختان مسن درخت ميوه زياد و ريزي توليد مي‌كند. ازعلائم ديگر بيماري آبله‌اي شدن (stem pitting) ساقه‌هاي كمتر از يك سال است. بر اثر فعاليت ويروس در بافت آبكش مواد غذايي به ريشه نمي‌رسد و درخت دچار زوال مي‌شود. در حالتهاي شديد باعث زرد شدن برگهاي انتهايي و توقف رشد آنها مي‌شود. متداولترين روش تشخيص بيماري تريستيزا روش تست Elisa است.

تنها راه مبارزه و پيشگيري بيماري تهيه پيوندك عاري از ويروس و پيوند آن روي يك پايه مقاوم است. البته بايد با ناقلين نيز به شدت مبارزه كرد. ازپايه‌هاي مقاوم نارنج poncirus trifoliata و راف لمون است. پايه‌هاي متحمل پرتقال، ليمو خاركي، نارنگي كلئوپاترا و ترنج است.

منابع مقاومت به بيماري ريزوماني

                                مؤسسه تحقيقات اصلاح و تهيه بذر چغندرقند

بيماري ويروسي ريزومانيا كه عامل آن ويروس زرد نكروتيك رگبرگ (BNYVV) مي باشد در سالهاي اخير از مزارع چغندرقند اكثر مناطق چغندركاري گزارش گرديده است. با انجام آزمون اليزا در ستاد مؤسسه از نمونه هاي ارسالي از مناطق مختلف وجود اين بيماري به اثبات رسيده است. اين بيماري باعث خسارت شديد به كميت و كيفيت محصول مي گردد و در حالت شديد باعث نابودي مزرعه چغندرقند مي شود. نظر به اينكه تنها راه مبارزه با اين بيماري استفاده از ارقام مقاوم مي باشد لذا مؤسسه تحقيقات اصلاح و تهيه بذر چغندرقند در جهت تهيه ارقام مقاوم اقدام نموده است. ارزيابي ژرم پلاسمهاي چغندرقند در مركز تحقيقات فارس انجام گرديد و خوشبختانه منابع مقاومت در بين ژرم پلاسمهاي مولتي ژرم و منوژرم مورد بررسي قرار گرفته شناسايي شد.

 

مزرعه آزمايشي ارزيابي ژرم پلاسم براي مقاومت به ريزومانيا

 

شرح يافته و توصيه هاي كاربردي : از انجام ارزيابي 128 لاين چغندرقند در مزرعه آلوده ايستگاه تحقيقاتي زرقان در مركز تحقيقات كشاورزي فارس و انجام آزمون اليزا در مقاطع مختلف رشدي لاينها در بخش گياه پزشكي دانشكده كشاورزي دانشگاه شيراز و ستاد مؤسسه در كرج معلوم گرديد كه منبع مقاومت در 3 لاين مولتي ژرم و 4 لاين منوژرم وجود دارد كه بررسيها براي تهيه رقم مقاوم در دست بررسي قرار دارند جدول زير وضعيت محصولي و غلظت ويروس را در لاينهاي انتخابي نشان ميدهد.

اهميت اقتصادي يافته : در حال حاضر ارقام مقاوم به بيماري ريزومانيا از خارج از كشور تامين مي گردد كه مستلزم پرداخت ارز براي ورود آنها مي باشد. با استفاده از اين منابع پرارزش در اصلاح ارقام از خروج ارز براي خريد بذر جلوگيري به عمل آمده و ارقام سازگار با شرايط آب و هوايي مناطق چغندركاري در كشور توليد خواهد شد.

اصلاح و تهيه ارقام مقاوم به كرلي تاپ

                           مؤسسه تحقيقات اصلاح و تهيه بذر چغندرقند

بيماري ويروسي كرلي تاپ (curlytop) يكي از بيماريهاي مهم چغندرقند مي باشد گرچه تاكنون از استانهاي فارس – مركزي – خراسان – كرمان – اصفهان و خوزستان گزارش گرديده است ولي شدت بيماري در استانهاي فارس – كرمان و اصفهان بيشتر از ساير استانها بوده و هرساله به توليد چغندرقند خسارت وارد مي آورد. بيماري علاوه بر بدشكلي در اندامهاي هوايي بوته ها – دواير متحدالمركز قهوه اي رنگي در مقطع ريشه هاي آلوده بوجود مي آورد و سبب كاهش وزن تا حدود 40% محصول مي شود. مؤسسه تحقيقات اصلاح و تهيه بذر چغندرقند در راستاي تامين كليه بذور چغندرقند مورد نياز كارخانه هاي قند كشور و به علت اهميت بيماري فوق توليد رقم تجارتي H5505 را با والدهاي مقاوم از شركت واندرهاو هلند از سال 1350 شروع نمود. با توجه به ايجاد لاينهاي مختلف چغندرقند با خصوصيات ژنتيكي مختلف، مؤسسه ارزيابي لاينها را جهت تعيين منابع مقاومت در برنامه هاي اصلاحي قرار داد كه با انجام ارزيابيها از سال 1360 موفق گرديد چهار لاين متحمل و مقاوم را پيدا نمايد.

بوته آلوده به بيماري ويروسي كرلي تاپ

شرح يافته و توصيه هاي كاربردي : با شناسايي لاينهاي متحمل و مقاوم و تائيد مقاومت لاين 16402 با آزمايشات گلخانه اي نسبت به انجام عمليات اصلاحي اقدام گرديده است. در آزمايشات مقايسه محصولي در منطقه فسا كه از آلوده ترين مناطق كشور به اين بيماري مي باشد معلوم گرديد كه اين لاين با آلودگي 7% و با شدت آلودگي كمتر از 1 در مقياس 0 تا 9 (صفر به منزله بوته سالم و 9 بوته شديداً آلوده) پتانسيل توليد 113 تن عملكرد ريشه در هكتار با عيار 19 درصد دارد. تهيه هيبريد ديپلوئيد و تريپلوئيد آن در دست توليد مي باشد و به زودي رقم مقاوم به كرلي تاپ با والدهاي ايراني معرفي خواهد شد.

اهميت اقتصادي يافته : با توجه به اينكه اين بيماري مي تواند خسارت هنگفتي به محصول چغندرقند وارد نمايد جايگزيني اين رقم با ارقام حساس در مناطق آلوده باعث توليد بيشتر با كيفيت برتر خواهد شد.

 

علایم ویروس y سیب زمینی

موزاييك،ابلقي كلروتيك و جين خوردگي شديد در برگها، كوتولگي گياه، خطوط قهوه اي رنگ در امتداد رگبرگهاي برگ، آويزان شدن برگ هاي پاييني خشك شده (leaf drop) ، لكه هاي نكروزه در برگ، كاشت غده هاي آلوده باعث ايجاد گياهان شديدا

" كوتوله مي شود، اما بروز آلودگي در اواخر فصل بدون اينكه علايمي ايجاد كند، توليد غده هاي آلوده مي كند.علايم موزاييك و پيسك (mottling) در دماهاي زير 10 درجه و بالاي 25 درجه سانتيگراد محو مي گردد.(Want,V.1987)

 

ویروس لکه حلقوی توتون در سویا

Tobacco ringspot nepovirus

The virus is transmitted by a broad range of vectors including a nematode (Xiphinema americanum), thrips (Thrips tabaci), spider mites (Tetranychus spp.), grasshoppers (Melanoplus app.), and possibly the tobacco flea beetle, (Epitrix hirtipennis). The virus is also seed-transmitted with up to 10% efficiency. Tobacco ringspot nepovirus (TRSV) has a wide host range that includes more than 17 dicot and monocot families. On soybean, TRSV causes bud blight of soybean, where the tips of branches turn a dark black and are curled down. This can be a severe disease and is associated with substantial losses of yield.

رده بندی ویروس ها

                                                  

برای رده بندی ویروسها ، سعی می‌شود که از فعالیت ذاتی ویروسها ، ساختار ساختمان اسید نوکلئیک و پوشش پروتئینی اطراف آن ، اندازه ویریون ، نوع اسید نوکلئیک ، صفات ژنتیکی ، حساسیت در مقابل عوامل فیزیکی ، شیمیایی و ... استفاده شود.

 در رده بندی ویروسها سعی بر این است که از خصوصیات مربوط به میزبان مانند نشانه گذاری کمتر ، استفاده شود، چون بسیاری از ویروسها بخصوص ویروسهای گیاهی ، با آنکه از نظر ریخت شناسی کاملا با هم متفاوت هستند، ولی در میزبان خود علائم ظاهرا مشابهی ایجاد می‌کنند.

 سیر تحولی رده بندی

برای سهولت مطالعه ویروسها آنها را بر حسب نوع میزبان به ویروسهای جانوری ، ویروسهای باکتریایی و ویروسهای گیاهی ، تقسیم بندی می‌کنند. این نوع رده بندی اگرچه مطالعه ویروسها را آسانتر می‌سازد، ولی مبنای علمی ندارد.

 قدیمی‌ترین روش رده بندی ویروسهای حیوانی بر مبنای اندام آلوده شده و بیماری تولید شده استوار بود و آن را مبنای علائم می‌نامند. چون یک نوع ویروس ممکن است بر حسب اندامی که مورد حمله قرار می‌دهد، بیش از یک نوع بیماری پدید آورد، لذا این نوع رده بندی از نظر میکروبیولوژیکی رضایت بخش نیست.

 در چند دهه گذشته صدها نوع ویروس از گیاهان ، جانوران و انسان جدا کرده‌اند. با افزایش تعداد ویروسهای شناخته شده مساله رده بندی پیچیدگی بیشتری پیدا می‌کند.

اساس طبقه بندی

میران اطلاعات قابل دسترسی در هر زمینه برای تمامی ویروسها ، یکسان نیست و روشی که بر اساس آن ویروسها شناسایی می‌شوند، به سرعت در حال تغییر است. امروزه اکثرا از بررسی توالی ژنی به عنوان یک روشی اولیه برای شناسایی ویروس استفاده می‌شود و بدین ترتیب نیاز به سایر اطلاعات کلاسیک نظیر چگالی شناوری ویروس، کاهش یافته است. داده‌های مربوط به توالی ژنی ، معیارهای پیشرفته طبقه بندی محسوب شده و گاهی باعث ایجاد خانواده‌های جدیدی از ویروسها می‌شوند. اساسهای طبقه بندی به صورت زیر است:

 مورفولوژی ویریون شامل اندازه ، شکل ، نوع تقارن و وجود یا عدم وجود غشا.

 خصوصیات فیزیکی _ شیمیایی ویریون شامل توده مولکولی ، چگالی شناوری ، پایداری در برابر تغییرات PH و حرارت ، حساسیت به عوامل فیزیکی و شیمیایی بویژه اتر و پاک کننده‌ها.

 خصوصیات ژنومی ویروس شامل نوع اسید نوکلئیک (RNA یا DNA) ، اندازه ژنوم ، نوع زنجیره (تکی یا مضاعف) خطی یا حلقوی بودن.

 خصوصیات پروتئینی شامل تعداد ، اندازه ، عملکرد پروتئین‌های ساختمانی و غیر ساختمانی ، ترتیب اسیدهای آمینه و تغییرات پس از ترجمه.

 سازمان ژنی و همانند سازی آن شامل طبقه بندی ژنی ، تعداد و موقعیت قالبهای خواندنی باز و نحوه همانندسازی.

 خصوصیات آنتی ژنی ویروس.

 خصوصیات بیولوژیک شامل تعداد میزبان طبیعی ، انتقال ویروس ، حشرات عامل ویروس ، پاتوژنز و پاتولوژی.

سیستم جهانی طبقه بندی ویروسها

در این سیستم ویروسها را بر اساس مورفولوژی ویریون ، ساختمان ژن و نحوه همانندسازی به گروههای بزرگتری تحت عنوان خانواده تقسیم بندی کرده و در انتهای نام هر خانواده ویروسی از پسوند « ویریده » استفاده می‌نمایند. در هر خانواده ویروس بر اساس تفاوتهای فیزیکی _ شیمیایی ، تقسیمات کوچکتری به نام جنسی نیز وجود دارد. معیارهایی که برای شناسایی هر جنس بکار می‌رود، از خانواده‌ای به خانواده دیگر متفاوت است. چند خانواده ویروسی که خصوصیات مشترکی با یکدیگر دارند، یک راسته ویروسی را تشکیل می‌دهند.

 در سال 1995 ، کمیته بین‌الملی طبقه بندی ویروسها بیش از 4000 ویروس جانوری و گیاهی را به 71 خانواده ، 11 زیر خانواده و 164 جنس و صدها ویروس که هنوز جایگاه آنها تعیین نشده است، تقسیم بندی کرد. امروزه مشخص گردیده که اعضای 24 خانواده ویروسی برای انسان و جانوران ، بیماریزا هستند.

 گروههای اصلی باکتریوفاژها (ویروسهای باکتریایی)

ویروس دارای دم درازی است که توسط غلافی قابل انقباض پوشیده شده است.

 ویروس دارای دم دراز و باریک و قابل ارتجاع ، فاقد غلاف قابل انقباض بر روی دم است.

 ویروس داری دم کوتاه و سر چند وجهی است.

گروههای اصلی ویروسهای جانوری

پوکس ویروسها :

 این ویروسها مولد بیماری آبله در انسان ، گاو ، خرگوش و پرندگان هستند.

 

 میکسو ویروسها :

 ویروسهای این گروه مولد بیماریهایی مانند آنفلوآنزا در جانوران مختلف هستند.

 

 پارامیکسو ویروسها :

 مولد بیماریهایی مانند سرخک ، اوریون ، پاراآنفلوآنزا و نیوکاسل در جانوران هستند.

 

هرپس ویروسها :

 ویروسهای این گروه بیماریهایی مانند زونا ، تبخال و آبله مرغان ایجاد می‌کنند.

 

 آدنو ویروسها :

 بیماریهای گوناگون در دستگاه تنفسی جانوران ایجاد می‌کنند، در انسان عامل نوعی تومور سرطانی شناخته شده‌اند.

گروههای اصلی ویروسهای گیاهی

گروه توبرا ویروس :

 ویروس جغجغه‌ای توتون (TRV) عضو اصلی این گروه است که بوسیله نماتدها انتقال می‌یابد. در شیره گیاهی بسیار پایدارند و معمولا در میزبان علائم نکروز ظاهر می کنند.

 

 توبامو ویروس :

 ویروس موزائیک توتون ، عضو اصلی این گروه است. ویروسی است بسیار پایدار و در گیاه علائم موزائیکی ایجاد می‌کند ناقل طبیعی خاصی برای این گروه شناخته نشده است.

 

 ویروس پژمردگی گوجه فرنگی :

 در بسیاری از گیاهان تولید موزائیک و نکروز می‌کند، در شیره گیاهی ناپایدار است و به آسانی به طریق مکانیکی (مالش) منتقل می‌شود. ظاهرا به ویروس آنفلوآنزا شباهت دارد.

 

 گروه رابدو ویروسها :

 ویروسهای این گروه در جانوران مهره‌دار ، بی‌مهره و در گیاهان یافت می‌شوند. از نمونه‌های گیاهی آن یکی ویروس زردی نکروزی کاهو است که بوسیله شته منتقل می‌شود و دیگری ویروس کوتولگی زرد سیب زمینی است که توسط زنجره‌ها انتقال می‌یابد.

 

ساتلايت ها

 

زمان خالص سازي ويروس ممكن است بيش از يك نوع آ.ر.ان.اي شناسايي گردد كه عبارتند از :

آ.ر.ان.اي ژنوسي ويروس ممكن است ويروس داراي ژنوم چند قسمتي باشد . مثل ويروسهاي متعلق به Tobravirue ، Comovirus ، Nepoviru        s ،  Dianthovirus.

 آ.ر.ان.اي زير ژنومی كه اين نوع آ.ر.ان.اي ممكن است در پوشش پروتئيني ويروس جايگيري شود . اينها قطعاتي از ژنوم ويروس است كه          براي آلودگي ضروري نمي باشند .

آ.ر.ان.اي ناقص مختل كننده : اين نوع آ.ر.ان.اي از ژنوم ويروس با حذف توالی هاي نوكلئوتيدی مشتق مي شوند بنابراين ژنوم اينها به            طور كامل يا عمدتاً از توالي هاي نوكلئوتيدي ژنوم ويروس تشكيل مي شوند و بازده ويروس كمك كاهش مي دهند . اين نوع آ.ر.ان.اي در             رابدو ويروسها و رئو ويروسها و جميني ويروسها وجود دارند .

بعضي از ويروسها آ.ر.ان.اي ژنوم گياه ميزبان را جهت تشكيل ويروس كاذب تشکيل مي دهند مانند TMV .

ساتلايت ها : به مولكولهايي گفته مي شود كه از نظر ترادفهاي نوكلئوتيدي تشابه قابل توجهي با ژنوم ويروس كمكي و ميزبان ندارند .                 معمولاً سنتز ويروس كمكي را تحت تأثير قرار مي دهند و در نتيجه مي تواند در بروز علائم ناشي از ويروس همراه خود تأثير گذار باشد          . اين مولكولها براي تكثير و در مواردي براي انتقال و جايگيري در پوشش پروتئيني به ويروس همراه خود وابسته است و در دهه 1940        يك جدايي از ويروس (Tobacco necrosis virus , TNV) شناخته شد ، كه حاوي دو پيكره كروي در دو اندازه متفاوت بود كه از             نظر مرولوژيكي نيز با يكديگر تفاوت داشتند . وابستگي پيكره كوچكتر براي تكثير به پيكره بزرگتر سبب نامگذاري آن با واژه Satellite  virus        و توصيف آن در سال 1962 گرديد .

در سال 1969 ، يك گونه جديد آ.ر.ان.اي با وزن مولكولي كم همراه با ويروس (Tobacco  ring spot nepovirus , TRSV)               گزارش گرديد . چند سال بعد مشخص گرديد كه اين آ.ر.ان.اي كوچك براي تكثير و انتقال به TRSV وابسته است . اين گروه بر خلاف          ويروسهاي وابسته توانايي كد كردن پوشش پروتئيني خود نيستند و از پوشش پروتئيني ويروس همراه خود استفاده مي كنند . اين                  مولكولها داراي ترادف نوكلئوتيدي متفاوت با ويروس همراه خود هستند براي اين مولكولها واژه Satellite RNA انتخاب گرديد          . چنين تعريفي بين ساتلايت ها و آ.ر.ان.اي زير ژنومي و همچنين (Defective Interfering RNA , DI RNA) مشتق                شده از ويروسها تمايز ايجاد مي كنند .

 

 

تعیین نقطه Cut -off تست الیزا

                                       دکتر سید جلیل ذریه زهرا

 در تعیین نقطه Cut -off تست الیزا به فرمول جالبی برخورد کردند که جالب است

Cut-0ff point = [M+ (3 × SD
M= The mean of OD values of all Negative Control Samples
SD= Standard deviation of Negative Control samples

مراحل انجام آزمون الایزا

 

1) ‌پوشش دادن كف چاهك هاي اليزا با IgG :‌

 براي اينكه كف چاهك را با IgG پوشش دهيم نياز است ابتدا IgG را رقيق كنيم براي اينكار از بافر كربنات (Coating Buffer) استفاده شد.

IgG به نسبت 500 / 1  رقيق شد يعني μl 10 از IgG را به cc 10 بافر كربنات اضافه كرديم و كاملاً بهم زديم. بعد از اين كار مقدار μl 100 از IgG محلول در بافر پوششي را به هر چاهك اضافه كرده و بعد از اينكه تمام چاهك ها پر شد روي پليت با يك پارافيلم پوشانيده شد. پوشانيدن پليت با پارافيلم براي اين است كه IgG تبخير نشود. سپس پليت اليزا در يخچال كه دماي آن C ˚ 4 سانتيگراد بود به مدت يك شب ماند اين كار به منظور اتصال بهتر IgG به كف چاهك انجام شد.

 

4) شستشوی چاهک ها با بافر شستشو:

بعد از اينكه IgG در چاهك ها به مدت يك شبانه روز ماند پليت اليزا را از يخچال خارج كرده و با سمپلر IgG اضافي را از چاهك ها خارج كرده و در داخل ظرفي كه مخصوص آنتي بادي است برگردانده شد. در اين مرحله باید دقت شود تا نوك سمپلر به كف چاهك ها برخورد نكند. (در صورت برخورد، IgG متصل شده به كف چاهك كنده شده و همراه با بقيه IgG هاي اضافی خارج مي شود)

چاهك ها را 3 بار و هر بار به مدت 5 دقيقه با بافر شستشو مي شوييم. براي اين كار بافر را با فشار كم وارد چاهك ها كرده تا IgG كف چاهك كنده نشود.

 

2) تهيه عصاره گياهی و افزودن آنتي ژن به چاهك ها ‌:

 براي تهيه عصاره گياه،‌ برگهايي را که قبلاً به آنها مشكوك هستيم و حاوي ويروس مورد نظر است را به قطعات ريز تكه تكه كرده و رگبرگ اصلي همراه با ساقه ها و دمبرگ ها جدا شده و فقط از پهنك برگ استفاده شد. سپس قطعات برگ درون هاون چيني ريخته شده و بافر عصاره گيري به نسبت 1 گرم از بافت برگ به cc1 بافر اضافه گرديد و با دسته هاون برگها  كاملاً خرد شده بطوريكه عصاره سبز گياه كاملاً خارج شد. سپس عصاره مخلوط با بافر استخراج در داخل تيوپ هايي كه قبلاً شماره گذاري شده بود ريخته شد. لازم به ذكر است كه كليه مراحل استخراج عصاره در هاون برروي یخ انجام شد و تيوپ هاي اپندورف بعد از پر كردن با عصاره در داخل يخ قرار داده شدند تا فعاليت آنزيم ها به حداقل كاهش يابد.

سپس μl 95 از هر عصاره داخل تيوپ را كشيده و به درون چاك ها ریخته شد. لازم است قبل از اين كار نقشه پليتي را كه مي خواهيم عصاره درون آن ريخته شود بكشيم و محل هر نمونه مشخص شود. به درون چاهک های حاشیه ای عصاره نمونه ریخته نمی شود و به جای آن با آب مقطر پر می شوند. علت اينكه فقط در چاهك هاي حاشيه اي آب مقطر ریخته می شود، ‌جلوگيري و حذف اثر زمينه اي (Back ground) است.

به غير از نمونه هاي مورد بررسي 2 چاهك را با عصاره نمونه سالم (شاهد منفي) و 2 چاهك با عصاره آلوده (شاهد مثبت) و دو چاهك نيز فقط با بافر عصاره گيري به عنوان بلانك پر گرديد.

 مجدداً  روي پليت با پارافيلم پوشانيده شده و جهت Over night به مدت 1 شب در يخچال در دماي  ˚c4 قرار داده شد.

 

5) شستشوی چاهک ها با بافر شستشو:

پس از ریختن عصاره گیاهی از درون چاهک های پلیت، چاهك ها را مانند مرحله قبل  3 بار و هر بار به مدت 5 دقيقه با بافر شستشو مي شوييم. براي اين كار بافر را با فشار كم وارد چاهك ها كرده تا IgG كف چاهك كنده نشود.

 

6) افزودن آنتي بادي متصل شده به آنزيم (IgG^_Conjugate)‌

IgG Conjugate همان IgG است كه در ستون كروماتوگرافي خالص شده و با گلوتار آلدئيد به آنزيم آلكالين فسفاتاز متصل شده است. بعد از اينكه عصاره ها را از داخل چاهك ها خارج كرديم 3 بار شستشو انجام داده شد. وبعد IgG Conjugate  به چاهك ها اضافه شد. قبل از اضافه كردن IgG Conjugate  آنرا به نسبت 500 / 1 رقيق کردیم. براي رقيق كردن مقدار   μl 2 از  IgG Conjugate  به cc 1 بافر Conjugate  باید اضافه شود و مقدار μl 90 از اين ترکیب را به هر چاهک اضافه می شود. پس از پر كردن همه چاهك های درونی (چاهک های حاشیه ای با آب مقطر پر می شوند) سطح پليت با پارافيلم پوشانيده شد و در داخل انكوباتور به مدت 4 ساعت در دماي 37 درجه سانتيگراد قرار گرفت.

 

6- اضافه کردن سوبسترا :

 بعد از 4 ساعت پليت اليزا را از انكوباتور خارج كرده و با سمپلر IgG Conjugate اضافي از چاهك ها كشيده و به ظرف مخصوص آن برگردانيده شد.  سپس همانند مراحل قبل چاهك ها را شستشو داده و در مرحله بعد سوبسترا به چاهك ها اضافه گرديد. براي اضافه كردن سوبسترا لازم است تا قرص آنرا در بافر سوبسترايي كه تهيه كرده ايم حل كنيم (سوبسترا را كه بصورت قرص پارانيترو فنيل فسفات  است بايد به نسبت mg / ml 1  در بافر سوبسترا حل كنيم).

    بنابراين        μl 9600 = μl   100   ×  96

مقدار مورد نياز سوبسترا براي كل پليت 96 خانه اي → ml 6/9 = μl 9600 → μl 1000 = cc 1

 يعني در مجموع 6/9 ميلي لیتر از تركيب فوق را نياز داريم تا به 96 خانه اضافه كنيم چون نسبت قرص  mg 1 در ml 1 از بافر است پس 9 ميلي گرم آنرا در cc 10 بافر بايد حل كنيم.

 پس از تهيه تركيب سوبسترا در محلول  بافر سوبسترا به ميزانμl  87  از بافر را كشيده و به چاهك اضافه مي كنيم. و به منظور جلوگیري از تاثير نور برروي سوبسترا پليت را در محل تاريكي قرار می دهیم. اگر حداكثر تا 2 ساعت پس افزودن محلول سوبسترا واکنش رنگ زایی در چاهك ها مشاهده نشد بايد پليت را  درون يخچال با درجه 4 به مدت 24 ساعت قرار دهيم. پس از واکنش رنگ زایی می توان به منظور توقف واكنش رنگ زايي به هر چاهك مقدار 10 ميكرو ليتر از محلول سود 3 مولار اضافه كنيم.

 در نهايت نتايج را يادداشت مي كنيم  و نتايج را با نقشه اي كه قبلاً كشيده ايم مورد بررسي قرار مي دهيم.

 

انواع آنتي بادي

- آنتي بادي پلي کلونال[1]: ملکول آنتي بادي با اپيتوپهاي[2] زيادي از ملکول آنتي ژن، ميل ترکيبي دارد. اين امر ناشي از توليد آنتي بادي توسط کلونهاي مختلفي از سلولهاي لنفوسيت B است.که هر کدام در مقابل يک اپيتوپ از آنتي ژن به ساخت IgG ميپردازند. لذا آنتي باديهاي پلي کلونال شامل IgG هاي مختلفي براي شناسايي و پيوند با اپيتوپهاي متفاوت آنتي ژن است.

2- آنتي باديهاي مونو کلونال[3] : اين نوع آنتي بادي تنها توسط يک کلون ازسلولهاي لنفوسيت B ساخته ميشود. که فقط يک اپيتوب از آنتي ژن را تشخيص داده و با آن پيوند برقرار ميکند. استفاده از

 آنتي باديهاي مونوکلونال براي تشخيص نژادهاي يک ويروس مرسوم است.

---

[1]Polyconolal

[2]Epitop

[3]Monocolonal

آزمونهاي سرو لوژيکي جهت شناسايي ويروسها

آزمونهاي سرلوژيکي جهت شناسايي ويروسها عبارتند از آزمون رسوب در محيط مايع، آزمون رسوب در ژل يا نشت ايمني، آزمون رسوب لوله، آزمون رسوب حلقه، آزمون رسوب ريز، آزمونهاي به هم چسبيدگي، روش تلفيق سرولوژي و ميکروسکوپ الکتروني، و ميکروسکوپ الکتروني با جذب ايمنيISEM ). هرچند روشهاي سرولوژي و تلفيق ميکروسکوپ الکتروني بسيار حساس و براي شناسايي ويروسها مفيدند؛ و در سالهاي اخير از روشهاي مهم در تشخيص ويروسها بوده اند  ولي براي آزمايش تعدادي زيادي نمونه روش عملي به شمار نميروند (). در اين موارد با استفاده از روش بسيار حساس الايزا ميتوان آزمايشات را انجام داد. روش الايزا اولين با توسط ولر و همکاران ابداع شد . تا کنون اشکال زيادي از اين روش براي تشخيص ويروسها مورد استفاده قرار گرفته است.

 

انواع الايزا

- الايزاي مستقيم: در اين روش آنتي بادي آنزيم دار مستقيماً با ويروس باند ميشود. روش ساندويچ آنتي بادي دو طرفه[2] (24) که مورد استفاده قرار ميگيرد نوعي الايزاي مستقيم است. اين تست سرولوژيکي بر روي پليتهاي 96 خانه اي انجام ميشود و در چاهکهاي آن واکنش ميان آنتي ژن با آنتي بادي بررسي ميگردد. در اين روش عکس العمل ميان آنتي ژن با آنتي بادي متصل به آنزيم الکالين فسفاتاز[3] بررسي ميشود وسپس ماده زمينه آنزيم افزوده ميشود و رنگ حاصل از واکنش به طور کمي اندازه گيري ميشود و ويروس در غلظت بسيار پايين شناسايي خواهد شد. چاهکهاي پليت از جنس پلي استايرن بوده که در ابتدا به وسيله گاماگلوبولين خالص شده از آنتي سرم (آنتي بادي) پوشش داده ميشود و سپس نمونه ويروس اضافه ميشود و بعد از آن آنتي بادي متصل به آنزيم افزوده ميشود. آنزيم متصل به آنتي بادي بر روي سوبستراي که در آخر افزوده ميشود اثر کرده و اين آنزيم باعث تجزيه فسفات سوبسترا ميشود که نتيجه آن ظهور رنگ زرد است. اين تغيير رنگ به طريق چشمي يا به وسيله دستگاه ELISA Reader به طور کمي اندازه گيري ميشود. آلکالين فسفاتاز آنزيمي است که اغلب براي اتصال به آنتي بادي مورد استفاده قرار ميگيرد و به وسيله سوبستراي پي نيتروفنيل فسفات شناسايي ميشود. هيدروليز سوبسترا معمولاً با افزودن هيدرو اکسيد سديم به چاهکها و قبل از اندازگيري واکنش رنگ متوقف ميشود.

2- الايزاي غير مستقيم[4]: در اين روش آنتي بادي نشان دار مستقيماً با ويروس باند نميشوند بلکه با يک آنتي بادي اختصاصي ويروس باند ميشود. در اين روش از آنتي باديهاي GAR استفاده ميشود.پس از تزريق آنتي ژن به بدن خرگوش و گرفتن آنتي يادي از خرگوش اين آنتي باديها را به بز تزريق ميکنيم و بز بر عليه اين آنتي باديها که براي بز آنتي ژن محسوب ميشود، آنتي بادي توليد کرده و در آخر اين آنتي باديهاي گرفته شده از بز را نشاندار ميکنيم. که به چنين آنتي باديهايي GAR گفته ميشود. که اين آنتي باديها در صورت برخورد با هريک آز آنتي باديهاي گرفته شده از خرگوش به آن ميچسبند (11). از مزاياي الايزاي غير مستقيم اين است که ترکيب آنزيم وآنتي بادي بز را ميتوان در مرحله سوم الايزاي هر ويروسي به کار برد. به شرط اينکه آنتي باديهاي اوليه که بر عليه ويروس به کار ميروند در خرگوش توليد شده باشند (6). روش NCM ELISA نمونه اي از  نمونه اي از الايزاي غير مستقيم است.

 

---

[1]Direct ELISA

[2]DAS-ELISA

[3]Alkalin phosphatase

[4]Indirect ELISA

ارزيابي نتايج اليزا

به منظور ارزيابي نتايج آزمون اليزا از دستگاه Elisa – reader و از طول موج 405 نانومتر استفاده شد. جهت به دست آوردن تغییر‌رنگ واقعي در چاهك ها و حذف جذب نور ديواره چاهك ها و بافر سوبسترا، ‌ميزان نور جذب شده توسط چاهك هاي بلانك از مقدار جذب نور ساير چاهك ها كسر مي گردد كه با دادن شماره چاهك بلانک به دستگاه اين عمل توسط خود دستگاه صورت مي پذيرد. براي تعيين حد آلودگي (R ) از فرمول 3X استفاده مي شود.

بدين منظور 3 برابر ميانگين جذب نور چاهك هاي شاهد (نمونه هاي سالم) محاسبه گرديد، چنانچه ميانگين جذب نور توسط چاهكهاي مربوط به يك نمونه بيشتر از R بود آن نمونه آلوده و اگر كمتر بود آن نمونه عاري از ويروس در نظر گرفته مي شود. ملاك ارزيابي جهت تعيين آلودگي،‌ ميزان جذب نور چاهك ها بعد از 1 ساعت در نظر گرفته مي شود.

 

توليد گياهان عاري از ويروس

توسعه گياهان عاري ازويروس يکي از مهمترين کاربردهاي بيو تکنولوژي گياهي است. ازنظر پاتولوژيستهاي گياهي کنترل بيماريهاي ويروسي ميتواند به دسته هاي زير تقسيم شود.1- حذف منبع آلودگي ويروس 2- دوري ازبيماريهاي ويروسي که به وسيله ناقلين انتقال پيدا ميکنند. 3- حمله مستقيم به ويروسها 4- توليد واصلاح واريته هاي مقاوم 5 – سازگار کردن روشهاي مخصوص براي تکثير.

خوشبختانه اصلي که وجود دارد اين است که ويروسها به وسيله بذر انتقال پيدا نميکنند و بذرها عاري از ويروس ميباشند. ولي بذرها کمتر مورد توجه براي کارهاي کلون کردن، هيبريد کردن و توليد واريته ها قرار ميگيرند. به دليل اينکه بذرها از نوترکيبي گامتها از طريق تکثير جنسي به وجود ميآيند، داراي هتروزيگوسيتي بالايي هستند و نميتوانند نتاج شبيه والدين از لحظ ژنوتيپي به وجود بياورند . از طرفي گياهاني که از طريق تکثير غير جنسي ازدياد مييابند ميتوانند نتاج شبيه به والدين توليد کنند ولي در تکثير غيرجنسي ويروسها ميتوانند منتقل شوند و جمعيت آنها از يک نسل به نسل ديگر افزايش پيدا ميکند و بعد از 4 تا 6 نسل، گياه 100% آلوده به ويروس ميشود. پس ابتدا بايستي يک پايه عاري از ويروس در گياه توليد کرد و با تکثير و ريز ازديادي آن تعدادي زيادي گياه عاري از ويروس توليد کرد .

توليد ژرم پلاسم عاري از ويروس تخصصي ترين مرحله توليد بذر سالم به شمار ميرود. براي اين منظور در گذشته از روش گزينش کلوني استفاده ميشد. به اين ترتيب که گياهان بدون علائم ويروسي در طي يک دوره گزينش انتخاب و به عنوان هسته اوليه بذري سالم تلقي ميگرديد. در طول دهه هاي گذشته و به دنبال توسعه روشهاي کشت بافت متدهاي مانند کشت مريستم و پروتکلهاي متنوعي مبتني بر کشت بافت ايجاد شده و با سطوح مختلف موفقيت، مورد استفاده قرار گرفتندکه در زير به آنها اشاره ميکنيم.

1- کشت مريستم

 کشت مريستم] اولين تکنيکي بود که به منظور حذف ويروسها در سيب زميني به کار رفت .يکي از متداولترين راههاي حذف ويروسها، جداسازي و کشت مريستم گياه آلوده به ويروس است . در اين روش مريستمهاي به طول 2/0 تا 7/0 ميلي متر در شرايط استريل از جوانه هاي انتهايي يا جانبي ساقه، گياه و يا گياهچه درون شيشه اي جدا و در محيط کشت مخصوص مريستم، کشت داده ميشوند و سپس گياهچه هاي حاصله، از جهت وجود ويروسها تست ميگردند مهمترين دلائل کشت مريستم در حذف ويروسها عبارتند از

1- وجود مواد بازدارنده براي ويروسها در سلولهاي مريستمي .

2-فقدان مواد لازم براي تکثير ويروسها در سلولهاي مريستمي .

3-فقدان سيستم آوندي تکامل يافته در مريستم جهت انتشار ويروسها

4- عدم وجود پلاسمودسماتا در سلولهاي مريستمي براي حرکت ويروسها از سلولي به سلول ديگر.

2- ترموتراپي

 ترموتراپي[ رشد گياه کامل يا کشتهاي درون شيشه اي در دماي بالا است (. که رايجترين روش حذف ويروسها ميباشد. در اين روش گياهان آلوده به ويروس را به مدت مشخصي در دماهاي بالا نگهداري کرده و سپس جوانه هاي جديد آنها را کشت ميدهند و يا از آنها مريستم برداري ميکنند. استفاده از گرما روش موثري براي غير فعال کردن بعضي از ويروسها است. به نظر ميرسد که گرما فقط بر عليه ويروسهاي ايزو متريک و بيمارهاي ناشي از مايکو پلاسما موثر ميباشد . آزمايشات انجام شده بر روي ويروسها و گياهان ميزبان نشان داده که وقتي گياهان با دماي بالا تيمار شدند غلظت ويروس در آنها کاهش يافته است . ظاهراً کاهش ويروس در گياه حرارت درماني شده، در نتيجه اثر منفي حرارت بر تکثير و توزيع ويروسها در گياه ميباشد ترموتراپي باعث ايجاد خلل در سنتز RNA ي تک رشته اي و دو رشته اي ويروس شده و مانع توليد فعاليتهاي پروتئينهاي پوششي و پروتئينهاي حرکتي که در حرکت ويروسها از سلولي به سلول ديگر از طريق پلاسمودسماتا و نيز در مسير طولاني حرکت در سيستم آوندي گياه شرکت دارند، ميشوند (). در خصوص سيب زميني ميتوان گياهان مستقر در گلدان ، گياهچه هاي درون شيشه اي و يا خود غده ها را ترموتراپي کرد. از طرف ديگر ميتوان براي انجام ترمو تراپي از آب گرم استفاده کرد. اين روش براي حذف بند پايان، قارچها، باکترها، و فيتوپلاسما بسيار مفيد است اما براي حذف ويروسها توصيه نميشود.

درمعرض قرار دادن گياهان کامل يا بافتهاي کشت شده به مدت طولاني در درجه حرارتهاي بالا معمولا باعث کند يا متوقف شده رشد طولي و يا مرگ گياهچه ميشود. در نتيجه نرخ بازدهي آن پايين است و ازطرفي محدوديت عمده اين روش اين است که همه ويروسها به اين تيمار حساس نيستند  به عنوان مثال ويروسهاي S , X سيب زميني به راحتي توسط حرارت درماني حذف نميشوند. لذا از روش کشت مريستم به عنوان روش مکمل حرارت درماني استفاده ميشود.

3- شيميو تراپي

شيميوتراپي،] استفاده از مواد شيميايي که بازدارنده ظهور علائم و تکثير ويروس در گياه آلوده ميباشد. به طورکلي شواهد نشان ميدهد که هر چند مواد شيميايي زيادي وجود دارد که از ايجاد علائم و تکثير ويروس ممانعت ميکند ولي مواد اندکي ممکن است وجود داشته باشند که ويروس را ريشه کن کنند.

مواد شيمييايي تحريک کننده رشد، مثل سيتوکنين، ويروس را در مدت کشت مريستم ريشه کن ميکنند ( و غلظت بالاي سيتوکنين، باعث ساخت پروتئين ميزبان بجاي پروتيين ويروس ميشود (. به هر حال مواد شيميايي تحريک کننده رشد ممکن است مستقيماً ويروس را غير فعال نکنند، بلکه ممکن است موجب تحريک مقاومت در گياه ميزبان شده که تحت شرايطي ميتواند ريشه کردن ويروس را موجب شوند .

 از شيميوتراپي به عنوان يک روش جايگزين به جاي حرارت درماني استفاده ميشود. مواد شيميايي مورد استفاده در اين روش باعث ممانعت يا دخالت در نسخه برداري ويروس يا حرکت آن در داخل گياهان شيمي درماني شده، ميشود. در اين روش با استفاده مواد شيمياي مخصوصي در محيط کشت گياهچه ها، يا محلول پاشي، باعث حذف ويروس از آنها ميشوند (. بسياري از ترکيبات ضد ويروسي عمدتاً باعث سنتز آنالوگهاي بازي ميشوند. مهمترين ماده شيميايي مورد استفاده در اين خصوص که نتايج بهتري را هم نسبت به بقيه شامل ميشود ريباويرين است. ريباويرين ريبوزيدي مصنوعي با نامهاي تجاري ويرازول، ويراميد ميباشد .

بنابر گزارشات محققان دانشگاه ديويس ريباويرن باعث افزايش بروز موتاسيون در ويروسها ميشود که اين موتاسيونها بر عليه ويروس عمل کرده و همانند سازي ويروس را متوقف ميكنند. با اين فرض جوانه هاي جديد گياهچه هاي موجود در محيط کشت حاوي ريباويرين، عاري از ويروس ميشوند. مکانيسم دقيق درمان به وسيله شيميو تراپي بخوبي مطالعه نشده است. احتمالاً ريباويرين در مورد ويروسهاي جانوري با ساختار Cap انتهاي 5^/ mRNA ويروس مداخله دارد و بسياري از ويروسهاي گياهي حساس به ريباويرين در انتهاي ^/5 RNA خود داراي Cap هستند. ولي مکانيسم دقيق هنوز مشخص نيست، اگرچه مساله تغييرات ژنتيکي در سيب زميني هاي تيمار شده با مواد شيمياي ضد ويروس گزارش نشده است، اما تمايل براي استفاده اين مواد کاهش يافته است زيرا برخي از گزارشات نشان داده شده که اين مواد ميتوانند سبب موتاسيون در گياه شوند (38 ، 40). وهمچنين قيمت اين مواد بالا ميباشد. بنابراين روش ترموتراپي نسبت به روش شيمي درماني به عنوان يک پيش تيمار قبل از مريستم برداري ترجيح داده ميشود .

-4- الکتروتراپي[

يکي از جديدترين روشهاي پيشنهاد شده براي حذف ويروسها استفاده از جريان الکتريسيته است. که از اين روش براي اولين بار در سال 1996 به منظور حذف PVX در سيب زميني استفاده شد (55). در اين روش از گياهان رشد کرده در محيط گلخانه ساقه هاي با چندين جوانه انتخاب و در معرض جريان الکتريکي در محيط الکتروفورز قرار ميگيرد و بعد از تيمار، نوک جوانه ها جدا و در محيط کشت قرار داده ميشوند. در معرض الکتريسيته قرار گرفتن بافتها موجب افزايش دماي آنها از 4 تا 10 درجه سانتي گراد ميشود (76،55). پاسخ ژنوتيپهاي مختلف به اين روش متفاوت است و باززايي جوانه هاي کشت شده در اين روش متفاوت است (). در اين روش توانايي حذف ويروس يا کارايي درمان (درصد گياهان عاري از ويروس درصد باززايي جوانه ها ) به شدت تيمار الکتروتراپي شده مربوط ميشود. ولي تشکيل گياهچه به شدت تيمار بستگي ندارد و فقط بستگي به ژنوتيپ گياه دارد. نتايج حاکي از آن است که در اين روش از نظر حذف تمامي ويروسها اثر الكتروتراپي در سطح احتمال 1% معني دار بوده است ولي اثر ترکيب ويروسي معني دار نمي باشد. به عبارت ديگر تيمارهاي مختلف الکتروتراپي از نظر حذف تمامي ويروسها متفاوت هستند (4). در اين روش ميزان حذف يک ويروس در ترکيبات ويروسي با کاهش انواع ويروسهاي ديگر افزايش نمي يابد. روش الکتروتراپي از جهت حذف ويروسها به طور يکسان عمل نميکند. بعضي از انواع ويروسها مانند کارلا ويروسها (PVS ) به نسبت کمتري حذف ميشوند. برخي ديگر مانند لوتئو ويروسها(PLRV ) به نسبت بيشتري حذف ميشوند.ممکن است دليل آن مربوط به شکل چند وجهي اين ويروس مربوط باشد . چرا که ويروسهاي ديگر مورد مطالعه از نوع رشته اي انعطاف پذير هستند ).

 با توجه به نتايج به دست آمده کارايي درمان در مورد هر روش محاسبه گرديده است .

کارايي درمان= درصد حذف ويروس x درصد باززايي گياهچه ها

تاریخچه کشت بافت و تولید گیاهان عاری از ویروس

 اساس کار کشت مریستم بر پایه کشف خاصیت Totypotency سلول، یعنی توانایی بازرویی یک موجود کامل از یک سلول است که در سال 1838 توسط شوان و شیلدن بنا شده است. کشت مریستم از اوایل قرن بیستم آغاز شد.  White (1934) اولین کسی بود که روی پراکندگی ویروس TMV در قسمتهای مختلف ریشه توتون کار کرد و حدس زد که مریستم گیاهان می تواند عاری از ویروس باشد (103). Morel (1948) اولین کسی بود که کشت عاری از ویروس مریستم انتهای جوانه را انجام داد و توانست گیاهچه های عاری از ویروس از گیاهان مبتلا به ویروس به دست آورد و فرضیه مصونیت مریستم نسبت به ویروس ها را مطرح کرد. تحقیقات Cornuet & Limasset در 1949 نشان داد که پراکندگی متفاوتی در گیاهانی که به طور سیستمیک آلوده می شوند وجود دارد. آنها با استفاده از روش های بیولوژیک و سرولوژیکی اثبات کردند که غلظت ویروس ها در جوانه ها 150 بار کمتر از برگ های در حال رشد است و این را مطرح کردند که نوک مریستم عاری از ویروس است. در همان زمان Holmes توانست گیاه کوکب را که عاری از ویروس TSWV بود با روش پیوند نوک مریستم روی ساقه زیرزمینی سالم تولید کند. بعد از آن Morel و Martin گیاهان سالمی را از بعضی رقم های گل کوکب و سیب زمینی آلوده به ویروس تولید کردند که با روش برش دادن مریستم و کشت آن در یک محیط کشت مصنوعی انجام شد.

نتایج حاصل از تحقیقات این افراد امکان جدیدی را برای کنترل بیماری های ویروسی فراهم آورد. پس از آن روشهای مختلف درمان گیاه (Therepy) و حذف ویروس مثل گرما درمانی و شیمی درمانی با استفاده از کشت بافت مورد مطالعه و استفاده قرار گرفت.

 

سرولوژي

 آزمونهاي سرولوژيکي ممکن است در تشخيص يک ويروس ناشناخته، روش نهايي و قطعي باشد. همچنين در مطالعه ارتباطات بين جدايه ها و يا نژادهاي مرتبط اهميت دارند. اين آزمونها بر اساس ظرفيت اتصالي که آنتي باديها با آنتي ژنهاي اختصاصي خود دارند، ميباشند. آنتي ژن (پادگن) ماده اي است که قادر است به هنگام وارد شدن به بدن جانور مناسب، واکنش ايمني ايجاد کند. به توانايي يک آنتي ژن به ايجاد پاسخ ايمني به ايمونوژيستي موسوم است و موادي که موجب اين پاسخ ايمني ميشوند ايمونوژن گفته ميشوند. اغلب ويروسهاي گياهي وقتي به بدن جانور مناسب مثل (خرگوش ،موش، اسب) و يا پرنده ( مرغ و يا بوقلمون) تزريق ميشوند، آنتي ژن موثري هستند و ميتوانند توليد آنتي بادي را تحريک کنند. از آنتي بادي توليد شده در آزمونهاي مختلف سرولوژيکي استفاده ميشود.  به سرم خون که حاوي آنتي بادي است، آنتي سرم گفته ميشود که از بقيه اجزاء خون جدا ميشود. ويروس کاملاً خالص براي تهيه آنتي سرمها لازم ميباشد. در غير اينصورت آنتي سرم تهيه شده حاوي مقادير زيادي آنتي بادي در مقابل پروتين گياه ميزبان نخواهد بود. آنتي سرم را ميتوان با تزريق سوسپانسيون ويروس خالص، درون رگ و يا در عضله جانور مورد آزمايش تهيه کرد. تعداد تزريقها بر اختصاصي بودن آنتي سرم توليد شده اثر دارد. اگر فقط يک يا دو تزريق انجام شود، فقط آنتي باديها در برابر تعيين کننده هاي آنتي ژنيک اصلي¹ توليد ميشوند و در نتيجه آنتي باديها خيلي اختصاصي خواهند بود. اگر شش بار يا بيشتر تزريق صورت گيرد، آنتي باديها يي در برابر تعيين کننده هاي آنتي ژنيک و فرعي به وجود خواهند آمد و آنتي سرمي با دامنه وسيع تر توليد خواهد شد. و اين آنتي باديها به طور اختصاصي با ناحيه کوچکي از آنتي ژنها واکنش ميدهند.

 خواص فيزيکو شيميايي آنتي بادي

آنتي باديها يا ايميونوگلوبين ها، پروتئينهاي Y شکل ميباشند، كه دو نوع ايميونوگلوبين با ويروس شناسي گياهي ارتباط دارند. نوع اول که توسط آنتي ژن، پس از برانگيخته شدن، توليد ميشود و IgM نام داردکه در اکثر موارد بعد از دو هفته ناپديد ميشود. IgM پنتامري است با ملکولهاي بزرگ 800-900 کيلو دالتوني که داراي ضريب رسوب حدود S19 ميباشد. ملکول گاما گلوبيني که از نظر سرولوژي مهم است IgG با وزن ملکولي حدود 150 کيلو دالتون و ضريب رسوب S5/6 ميباشد. IgG مرکب از دو زنجيره دراز يا سنگين با وزن ملکولي 70-50 کياو دالتون و دو زنجيره کوتاه يا سبک با وزن ملکولي حدود 23 کيلو دالتون ميباشد. اين آنتي باديها داراي طولي تقريباً 10 نانومتر هستند، که برابر با يک سوم قطر ذره اکثر ويروسهاي کروي شکل و تقريباً برابر با عرض تعدادي از ويروسهاي دراز ميباشند .

شکستن آنتي باديها به قطعات F توسط آنزيمها امکان پذير است. هر آنتي بادي داراي دو محل متغيير و مخصوص براي پيوند با آنتي ژن در قسمت F_ab است. قسمت F_C غير قابل تغيير بوده و در بسياري از آزمونهاي سرولوژيکي بسيار مهم ميباشند. اگرچه قسمت F_C براي آنتي ژن تحريک کننده آنتي بادي، غير اختصاصي است اما براي حيواني که در آن، اين قسمت F_C  توليد شده است اختصاصي است. اين قسمت به نوبه خود زماني که به يک حيوان ديگر وارد بشود، توليد آنتي بادي اختصاصي اين آنتي بادي را تحريک ميکند.
 

انتقال ويروسهاي گياهي

هيچ ويروسي به خودي خود از گياه خارج نميشود و به وسيله آب، باد و عوامل ديگري نظير اينها انتقال نمي يابد. انتقال ويروس در طبيعت بيش از هر پاتوژني به موجود زنده وابسته است. ويروسها ميتوانند از طريق ازدياد گياهان به وسيله قلمه، پيوندک، پاجوش، غده و يا از راه مکانيکي و يا حشرات انتقال پيدا کنند. به موجود زنده اي که ويروس را از منبع آلوده کسب کند و تحت مکانيسم خاص به گياه سالم انتقال دهد، اصطلاحاً ناقل[1] ميگويند. امروزه مشخص شده که تعدادي از شکم پايان، کنه ها، نماتد ها وقارچها نيز، ناقل ويروسهاي گياهي ميباشند (6 ،3 ).

 

2-4-2- حرکت ويروس در گياه

براي ايجاد آلودگي در گياه ويروس بايستي از سلولي به سلول ديگر حرکت کند. ويروس در گياه به دو صورت حرکت ميکند، حرکت اول کند بوده و در اين حركت ويروس از راه پلاسمو دسماتا[2] از سلولي به سلول ديگر انتقال مي يابد که اين نوع حرکت در ابتداي آلودگي گياه به ويروس انجام ميگيرد. سرعت حرکت ويروس بسته به نوع سلول، سن سلول، و نوع ويروس فرق ميکند. حرکت ويروس در سلولهاي جوان و بلند سريعتر از سلولهاي کوتاه و پير است. همچنين سرعت حرکت آنها در حرارت بالاتر بيشتر از حرارتهاي پايين است. علت اين اين امر شايد به خاطر زياد شدن حرکت پروتو پلاستي و فعاليتهاي سلولي  باشد. حرکت دوم سريع ميباشد و در اين حالت ويروس غالباً از راه آوندهاي آبکش و احتمالاً در سلولهاي غربالي آنها به حرکت در ميآيد. سرعت حرکت ويروس در آوندهاي آبکش در شش دقيقه آول آلودگي 15 سانتي متر است (3،6، 11).

 

2-5- خصوصيات اصلي برخي از ويروسهاي سيب زميني

2-5-1- PLRV

ويروس لوله اي شدن برگ سيب زميني[3]يكي از مهمترين ويروسهاي سيب زميني ميباشد که به نامهاي ويروس نكروز بافت آبكشي، پيچيدگي برگ سيب زميني و نكروز شبكه اي سيب زميني معروف است (27 ). اين بيماري نه فقط باعث كاهش قابل ملاحضه اي در محصول ميشود، بلكه سبب نكروز غده ها نيز ميشود (7، 19، 20). احتما لاً اين ويروس مهمترين ويروس سيب زميني ميباشد.

علائم : اين ويروس هيچ علائمي بر روي گياهان كشت بافتي كه به وسيله اين ويروس تلقيح شده باشند ايجاد نميكند (49). گياهاني كه از غده آلوده اين ويروس به وجود ميآيند كوتوله و رنگ پريده هستند و داراي رشد عمودي ميباشند. همانطور كه نام اين بيماري نشان ميدهد برگها بخصوص برگهاي پاييني لوله اي ميشوند و چون اين ويروس در آوند آبكش فعاليت ميكند بنابراين تجمع آن در آوند آبكش باعث عدم انتقال مواد ساخته شده در برگها، به ريشه شده و ميزان كربوهيدراتها در برگها بالا رفته و در نتيجه خشبي و شكننده ميشوند. اولين علائم بيماري حدود يك ماه پس از كاشت و يا هنگامي كه رشد بوته ها به 15 سانتي متر رسيد مشاهده ميشود. بوته هاي بيمار غده هاي كمتر و كوچكتري نسبت به گياهان سالم توليد كرده و در نتيجه ميزان محصول كاهش مي يابد. گياهاني كه در طول فصل رويشي آلوده ميشوند، در صورت نشان دادن علائم كوتولگي داراي علائم خيلي مختصري خواهند بود. آلودگي در ابتداي فصل موجب لوله اي شدن مشخص برگچه هاي انتهاي بوته ميشود و در قاعده برگچه هاي جوان نيز مواد ارغواني رنگ ممكن است به وجود آيند (4).

مشخصات پيكره ويروس : ويروس لوله اي شدن برگ سيب زميني يک لوتئو ويروس[4]از خانواده لوتئو ويريده ميباشد، كه پيكره هاي ايزومتريك آن26-24 نانومتر قطر دارند و به صورت شش وجهي ميباشند. 28% پيكره ويروس شامل ژنوم RNA تك رشته اي با وزن مولكولي210 دالتون و 72% آن شامل پوشش پروتيني به وزن 3/26 كيلو دالتون ميباشد. اين ويروس داراي 5987 نوكلئوتيد و RNA ساب ژنومي آن داراي 2300 نوكلئوتيد ميباشد (60)، كه پوشش پروتيني اين ويروس را كد ميكند و از 180 زير واحد تشكيل شده است (41).

ميزبانها : در طبيعت سيب زميني ميزبان اصلي PLRV است و اكثر ميزبانهاي اين ويروس در خانواده سولاناسه واقع شده اند. برخي از گياهان ميزبان خانواده سولاناسه اين ويروس عبارتند از Solanum dulcamara,S.Villosum,Datura stramanium,D.tatula كه علائمي شامل كوتولگي ،كلروز، لوله اي شدن برگها ونكروز بافت آبكشي را ايجاد ميكنند. از ميزبانهاي غير سولاناسه اي اين ويروس ميتوان     Amaranthus caudatus,Celori argentea  ,Gomphrena globosaرا نام برد.

انتقال : اين ويروس مانند اغلب ويروسهاي سيب زميني از طريق غده منتقل ميشود. اين ويروس به طريقه مكانيكي منتقل نميشود (46). به دليل تجمع و انتشار PLRV به سلولهاي آوند آبكشي،اين ويروس در بافت اپيدرم گياه يافت نميشود. تنها روش انتقال آن پيوند و استفاده از ناقلين است. چندين شته اين ويروس را از طريق پايا و گردشي منتقل ميكنند،كه از مهمترين آنها ميتوان شته سبز هلو[5]  را نام برد. ازشته هاي ديگر ناقل اين ويروس ميتوانAphis nasturtii , Aphis faba, را نام برد.

 

2-5-2- PVY

ويروس Yسيب زميني از مهمترين ويروسهاي سيب زميني ميباشد، كه در سراسر جهان خسارتهاي زيادي را وارد ميكند. ميزان خسارت آن بسته به نژاد ويروس به 100%هم ميرسد. اين ويروس به نامهاي ويروس لكه نواري منقوط، ويروس نكروز اكروپتال، ويروس رگبرگ نواري سيب زميني، ويروس لكه نواري و ويروس موزائيك شديد سيب زميني معروف است )15، 26 ،27).

علائم : علائم اين ويروس برحسب سويه و رقم سيب زميني كاملاً متفاوت است. از نظر شدت، از علائم ضعيف تا نكروز برگي شديدو مرگ بوته هاي آلوده فرق ميكند. به طور كلي pvy داراي سه نژادpvyⁿ, pvy^c, pvy^o ميباشد (16،29). شايع ترين آنها نژاد pvyⁿ ميباشد. البته نژاد جديدي در سال 2000 در نواحي آند گزارش شد كه برخلاف ساير نژادهاي كه بر روي سيب زميني باعث بروز لكه موضعي ميشوند هيچ علائمي در آن ايجاد نميكند، ولي روي توتون مثل نژاد n موجب نكروز ميشود (74،7).

به طور كلي  pvy ^oوpvy ^c علائم شديد تري را نسبت به pvyⁿ ايجاد ميكنند. علائم اوليه pvy ^o بسته به رقم سيب زميني شامل نكروز، ماتلي شدن، يا زردي برگچه ها، افتادن برگها و گاهي مرگ زودرس ميباشد.pvy ^c موجب نكروز داخلي و يا خارجي در برخي از ارقام ميشود. pvyⁿ  باعث ايجاد ماتل مبهمي در گياهان با آلودگي در فصل جاري (اوليه)و در گياهان حاصل از غده هاي آلوده

(آلودگي ثانويه) ميشود (26، 30، 75).

مشخصات پيكره ويروس : ويروسY سيب زميني يک پوتي[6]ويروس و از خانواده پوتي ويريده ميباشد که به صورت رشته هاي نخي شكل به طول 730 نانومتر و عرض 11 نانومتر ميباشد. داراي ژنوم RNA ي تك رشته اي ميباشد كه حدود 6% كل پيكره را ژنوم ويروس تشكيل ميدهد وبه صورت ps-ssRNA ميباشد . بقيه پيكره را پوشش پروتئيني به وزن مولكولي 3400 دالتون تشكيل ميدهد، كه شامل 2000 زير واحد است. اين ويروس داراي 9074 نوكلئوتيد ميباشد (65)،كه تنها يكORF[7] با حدود 9000 نوكلئوتيد دارد. ساختار انتهاي^/5 آن vpg و ساختار انتهاي ^/3 آن Capميباشد. پايداري آن در عصاره در دماي 20 درجه سانتي گراد 5 تا 7 روز و پايداري آن در برگ نگهداري شده در دماي 4 درجه سانتيگراد، 15 سال است. دماي بي اثر شدن آن به مدت 10 دقيقه در مورد نژاد O,Cتا 62درجه و براي نژاد N تا 64 درجه سانتي گراد است.

ميزبانها : اين ويروس اكثراً به خانواده سولاناسه حمله ميكند، اما گاهي اوقات به خانواده اسفناجيان و بقولات نيز حمله ميكند. در توتون در بيشتر سويه ها موجب روشن شدن رگبرگ و به دنبال آن ماتلي شدن ميشوند. سويه هاي نكروزي PVY^N باعث ماتلي و برنزي شدن رگبرگهاي اصلي و نكروز برگها ميشود. سويه هايPVY ^O  و PVY ^C در P.florida موجب نکروز موضعي و سيستميک در گياه ميشود. ارقام سيب زميني مانند داک آف يورک براي شناسايي بيشتر نژادهايPVY مورد استفاده قرار ميگيرند.اين گونه ارقام پس از پيوند خوردن با^, PVY ^N, PVY ^O,PVY ^cبه ترتيب ماتلي شدن، موزائيک، رگوز و نوار منقوط را نشان ميدهند.

انتقال : ويروس y سيب زميني به طريقه مکانيکي به راحتي منتقل ميشود. همچنين از طريق غده نيز منتقل ميشود. اين ويروس به وسيله 73 گونه شته منتقل ميشود، که رابطه آن با شته به صورت غير پايا است (15).براي انتقال کافي است که شته 15 دقيقه تا 4 ساعت روي گياه آلوده تغذيه کند و ويروس را کسب کند. در بين شته ها شته سبز هلو معولترين و موئثرترين شته ناقل ويروس است. ساير شته هاي ناقل عبارتند از M.cetus, M.orantus اين ويروس همچنين توسط کنه Letanches نيز منتقل ميشود.

 

2-5-3- pva

اين ويروس به موزائيک خفيف سيب زميني معروف است ودر اکثر مناطق کشت سيب زميني شايع است و ميتواند بازده محصول را 40%کاهش دهد (27،7). اين ويروس اولين بار در سال 1932 معرفي شد .

علائم: علائم روي برگها شامل موزائيک خفيف و پيچيدگي مختصر برگهاي آلوده ميباشد. معمولاً چروکيدگي مختصري در برگها ديده ميشود. بوته هاي آلوده معمولاً باز به نظر ميرسند، زيرا ساقه هايشان به طرف بيرون خميده ميشوند (18) .شدت ظهور علائم بيشتر به شرايط آب و هوايي ،رقم سيب زميني و به نژاد ويروس بستگي دارد. در دماي بالا و در هواي روشن آفتابي، شناسايي علائم مشکل تر از هواي سرد وابري ميباشد. علائم اين بيماري در روي غده ها قابل تشخيص نيست (18).

مشخصات پيکره ويروس: ويروسA سيب زميني يک پوتي ويروس  و از خانواده پوتي ويريده ميباشد. ويروسي رشته اي به ابعاد 15x 730 ميباشد که داراي ژنوم RNA تک رشته اي ميباشد. اين ويروس داراي 9585 نوکلئوتيد ميباشد (65). بيشتر خصوصيات ژنوم و پروتين پوششي آن شبيهPVY ميباشد و تنها از مکانيسم پلي پروتين جهت همانند سازي بهره ميبرد. دماي نهايي بي اثر شدن اين ويروس46 تا 52 درجه سانتي گراد ميباشد. در دماي اتاق 12 تا24 ساعت قدرت آلودگي کنندگي آن دوام دارد.

ميزبانها: ميزبانهاي PVA محدود به خانواده سولاناسه هستند.درتوتون نژادهاي ويروس موجب روشن شدن رگبرگ و ماتل پراکنده ميشوند.در حاليکه درN.itabacum و White Burley روشن شدن و نواري شدن رگبرگ ايجاد ميشود (18). Solanum  demissum .در برابر PVA لکه هاي نکروزي وضعي در برگ يا نکروز سيستميک ساقه به وجود ميآورد. وگياه محک اين ويروس به شمار ميرود.

انتقال:PVA  به وسيله حداقل 7 گونه شته از جمله  شته سبز هلوو شته سيب زميني به طور غير پايا منتقل ميشود.اين بيماري توسط غده ها و به روش مکانيکي با عصاره گياهي و پيوند منتقل ميشود.انتقال با بذر حقيقي و سس گزارش نشده است. (18،6 ،7).

 

2-5-4- PVS

ويروس S سيب زميني تا اوايل سال 1950 ميلادي ناشناخته بود. اين ويروس اولين با توسط اوبوتر در سال 1952 از هلند معرفي شد و امروزه تقريباً در سراسر دنيا، در هر جا که سيب زميني کشت ميشود وجود دارد. ميزان خسارت آن بسته به رقم سيب زميني و نژاد ويروس متفاوت است. اين ويروس علاوه برکاهش مستقيم محصول، اثر تشديد کنندگي بر خسارت ويروسهاي مهم تر مثل PVX , PVY دارد(27). گياهان آلوده غده هاي کوچکي توليد ميکنند و غده هاي آلوده مهمترين منبع انتشار PVS در مزرعه هستند. اين ويروس ابتدا نه از طريق علائم حاصل از آن بلکه از طريق سرم شناسي، در طي تلاشهايي که براي توليد آنتي سرم در مقابل ويروس A سيب زميني صورت گرفت، پيدا شد(7).

علائم: اين ويروس دربسياري از ارقام معمولي سيب زميني بدون علامت است. علائم شامل فرورفتگي جزئي رگبرگها و رگوزي شدن برگها و احتمالاً کم رشدي و تيپ رشدي بازتر ميباشد. بعضي از سويه ها ميتوانندموجب ماتلي يا برنزي شدن در ارقام معيني شوند و يا هنگامي که شديد باشند، ميتوانند لکه هاي نکروزي در سطوح فوقاني ايجاد کنند، در برگهاي مسن تري که در سايه هستند ممکن است به جاي اينکه رنگ زرد يکنواخت به وجود آيد، لکه هاي مايل به سبزي ايجاد شود. آب و هواي ابري علائم را تشديد ميکند.

مشخصات پيکره ويروس: ويروس S سيب زميني يک کارلا ويروس ميباشد که به صورت رشته اي  نخي شکل به طول 650 و عرض 12 نانومتر است. وزن ملکولي پوشش آن 33000 دالتون ميباشد. ژنوم ويروس از rnaي تک رشته اي ميباشد، که داراي 7500 نوکلئوتيد به وزن10⁶x 39/2 دالتون بوده و داراي 2 ساب ژنوم به وزن 10⁶x1 و10⁶x7/0 دالتون ميباشد. ساختار انتهاي ^/5 آن cap و ساختار انتهاي ^/3  آن پلي a بوده و داراي 6 قاب قرائت باز است.

ميزبانها: pvs 20 تا 30 روز پس از تلقيح  روي انواع سلمه تره باعث ايجاد زخمهاي موضعي کلروزه ميشود و در برگهاي پير زرد شده اين لکه ها با هاله سبز احاطه ميشوند. لذا گياهان محک اين ويروس بشمار ميروند. 25 روز بعد از تلقيح روي سيب زميني باعث ايجاد لکه هاي نکروزه سيستميک ميشود.20 روز پس ار تلقيح در توتون برگهاي تلقيح شده علائمي نشان نميدهند. ولي در ساير برگها ، رگبرگها روشن شده و پيسيک و نکروز سيستميک ديده ميشود

انتقال: اين ويروس به راحتي با روش مکانيکي منتقل ميشود. ابزارهاي کشاورزي به خصوص موقع بريدن غده ها براي کاشت، تماس برگها و صدمات مکانيکي در طول مراحل داشت موجب انتقال اين ويروس ميشود. برخي از نژادها با شته سبز هلو و بعضي گونه هاي ديگر شته ها منتقل ميشوند. اين ويروس از طريق بذور حقيقي سيب زمني قابل انتقال نيست و غده ها عامل انتقال ويروس به سال بعد هستند.

2-6- بيو تکنولوژي در سيب زميني

فائو اعتقاد دارد که براي تامين غذاي روز افزون دنيا در بيست و پنج سال آينده، عملکرد محصولات زراعي بايستي به ميزان 60% افزايش پيدا کند، در حاليکه منابع طبيعي و بالطبع منابع غذايي  روز به روز محدود تر ميشوند. به عقيده متخصصان علوم کشاورزي براي حل مشکل تامين غذا و حفظ سلامت محيط زيست، راهکاري به جز فناوري مهندسي ژنتيک و بيو تکنولوژي وجود ندارد. آگاهان علم بيو تکنولوژي معتقدند که گياهان تراريخت ميتوانند توليد غذا را تا 25% در کشورهاي در حال توسعه افزايش دهند و غذاي 3 ميليارد جمعيت اضافي را تامين کنند. بنابراين بيو تکنولوژي تکنيک جديد بشر براي مقابله با مشکلات و معضلات تامين غذا و حفظ محيط زيست در آينده است (69).

يکي از روشهاي بيو تکنولوژي که دردهه اخير مورد استفاده قرار گرفته است متد کشت سلولها و بافتهاي گياهي در محيطهاي مصنوعي ميباشد. سيب زميني اولين محصول عمده خوراکي بود که کاربرد بيو تکنولوژي در آن موفق بوده است. گياهان عاري از بيماري توليد شده در شرايط آزمايشگاهي به مزارع انتقال يافته و درمقياس وسيع در کشورهاي مختلف تکثير گرديده است (8).

 

 

آزمون DAS – ELISA

 

A ( تهیه بافر های مورد نیاز آزمون الیزا:‌

ابتدا بافرهاي لازم جهت الايزا تهیه شدند. چون مواد مورذ نیاز طبق پروتکل براي 1 ليتر در نظر گرفته شده است، در اين آزمايش مقدار مواد بر حسب مقدار بافر مورد نیاز استفاده شده است :‌

 

1-    بافر (1x) PH = 7.4  (Phosphat salin Buffer) PBS

         ml 500                                         ml 1000

Nacl                                             8 gr                                         4gr

KH₂PO₄                                    2/0 gr                                       1/0gr

Na₂HPO₄                                 15/1 gr                                    57/0 gr

KCl                                          2/0 gr                                      1/0 gr

 

 براي تهيه اين بافر، مواد با مقدار فوق  وزن گرديد و در داخل يك بشر ريخته و مقداري آب مقطر به آن اضافه شد. براي حل شدن كامل مواد در آب، ‌يك مگنت در بشر گذاشته و بشر روي دستگاه استرير قرار داده شد تا مواد كاملاً در آب حل شود. سپس pH آن با دستگاه pH-meter  اندازه گيري شد. چنانچه PH محلول مورد نظر بالاتر بود با افزودن HCl و در صورت پایین بودن با NaOH میزان pH تنظيم می شود.

بعد از تنظيم PH با آب حجم محلول به cc 500 رسيد. از اين cc 500 بافر cc 50 آن جهت تهيه بافر Conjugate و cc 50 براي تهيه بافر عصاره گيري (Extraction Buffer) ‌و cc 400 باقيمانده  براي تهيه بافر شستشو (Washing Buffer) استفاده گرديد.

2-    بافر شستشو Washing Buffer PH = 7.4  (PBS –T)

                              ml 400                        ml 1000  

                              0.5 ml                        200 μl                  Tween 20

 براي تهيه اين بافر مقدار گفته شده از  Tween 20 در همان مقدار از بافر PBS كه در بالا گفته شده حل شد. ابتدا بايد pH بافر روی 7.4 تنظیم شده و سپس حجم بافر با افزودن آب به cc 400 رسید.

 

3-    بافر عصاره گيري (Extraction Buffer) PH = 7.4

تركيبات زير با نمك هاي مورد نياز جهت تهيه بافر PBS ادغام شد. و پس از تنظيم pH محلول همانند مراحل قبل كل حجم محلول به cc 50 رسيد.

                             cc 50                            ml 1000

                             gr 1                             gr 20                        PVP MW 24000

                             μl 200                         ml 5/0                     Tween 20

 

4-    بافر پوشش دهنده PH = 9.6  (Coating Buffer)

                          cc 50                     ml 1000 

                         gr 07/0                  gr 59/1                      Na₂Co₃

                        gr 15/0                  gr  93/2                  NaHCo₃  

                        gr 2%                    gr   2/0                         NaN₃   

 همانند مراحل  قبل  مواد گفته شده وزن شد و پس از تنظيم PH به حجم cc 50 رسيد.

 

5-    بافر تركيب پادتن – آنزيم (Conjugate Buffer)   PH = 7.4

                            cc 50                  ml 1000

                           gr 1                   gr  20                PVP MW 24000  

                         μl 20                     ml 5/0                  Tween 20

                         gr  1/0                  gr 2                      egg albumine 0.2%    

نمك هاي بالا به بافر PBS اضافه شد و پس از همزدن و تنظيم pH حجم آنها به cc 50 رسيد.

 

6-    بافر سوبسترا  PH = 9.8  (Substrate Buffer) 

                             ml 20                    ml 1000

                            ml 944/1                   ml 97              diethanolamine

تنظيم براي اسيديته از طريق اسيد هيدروكلريك (HCL) صورت مي پذيرد.

آزمون DAS – ELISA برای شناسايي ویروس BCMV

مراحل آزمایش:

 

1) رقیق کردن IgG خالص به نسبت 1:500در بافر کربنات (Coating buffer)

 

Coating buffer (pH 9.6) for 1000 ml

          Na₂CO₃       1.59 g

          NaHCO₃      2.93 g

          NaN₃           0.20 g

مواد بالا ابتدا درون ml900 أب حل مي شوند، پس از تنظیم pH با HCl يا NaOH حجم نهايي به 1 ليتر مي رسد.

 

2) افزودن lµ 100 از IgG رقيق شده درون هر چاهک

 

3) قرار دادن پلیت الیزا در انکوباتور با دمای cْ 37 براي 4-2 ساعت، پس ازپوشاندن آن با پارافیلم

و يا قرار دادن آن در یخچال با دمای cْ 4 براي يك شب

 

4) شستن چاهک ها با بافر شستشو (Washing buffer)، سه بار و هر بار 5 دقیقه

 

PBS (pH 7.4) for 1000 ml

          NaCl            8        g

          KH₂PO₄       0.2     g

          Na₂HPO₄     1.15   g

          KCl             0.2     g

          NaN₃           0.2     g

 

PBS-T

PBS + 0.5 ml Tween20 for 1000 ml (50 µl for 100 cc)

 

5) تهیه عصاره گیاهی درون هاون چینی سرد با خرد کردن نمونه های برگی در بافر استخراج با نسبت 1:1

 

Extraction buffer

          PBST + 2% PVP (2 g for 100 ml)

 

6) افزودن lµ100 از عصاره هر نمونه به هر چاهک

 

7)پوشاندن پلیت با پارافیلم و قرار دادن پلیت الیزا در دمای cْ 4 به مدت یک شب

 

8) شستشوی چاهک ها با بافر شستشو، سه بار و هر بار 5 دقیقه

 

9) رقیق کردن آنتی بادی متصل به آنزیم (IgG^_conjugate) به نسبت 1:500در بافر ترکیب پادتن^_آنزیم

 

Conjugate buffer

          PBST

          PVP 2%

          Egg albumine 0.2%

 

10) ريختن lµ 100 از IgG^_conj. رقيق شده در هر چاهک

 

11) پوشاندن پلیت با پارافیلم و قرار دادن آن در انکوباتور با دمای cْ 37 به مدت 4 ساعت

 

12) شستشوی چاهک ها با بافر شستشو، سه بار و هر با 5 دقیقه

 

13) تهیه محلول تازه سوبسترا از طریق حل كردن یک قرص mg 5 پارانیتروفنیل فسفات در cc 10 بافر سوبسترا

 

Substrate buffer (pH 9.8) for 1000 ml

          diethanolamine       97 ml

          H2O                      600 ml

NaN₃                     0.2 g

پس از تنظیم pH محلول با HCl یا NaOH حجم نهایی محلول به ml 1000 می رسد.

ویروس پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی

ویروس پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی از ویروس های مهم جنس بگومو ویروس است که گسترش جهانی داشته و تا 100 % خسارت درمورد آن گزارش شده است. توسعه غیرمنتظره و تدریجی این ویروس در نواحی جنوبی و مرکزی ایران، ضرورت شناسایی دقیق نژادهای این ویروس و بهره گیری از تکنیک های پیشرفته و دقیق در این خصوص و نیز بررسی تغییرات ژنتیکی جمعیت آنها در جهت کنترل مؤثر این عامل بیماری زا را ایجاب می نماید(بهجت نیا، 1383). با توجه به ماهیت غیر قابل کنترل ویروس ها، اصلی ترین راهکار در کنترل آنها عمدتا" بر پیشگیری از وقوع و گسترش آنها با استفاده از مواد تکثیری سالم و عاری از ویروس می باشد.

روش های ردیابی با بررسی روش های انتقال، روش های سرولوژیک نظیر تاس-الایزا و روش های مولکولی نظیر PCR وتعیین توالی نوکلئوتیدی برای شناسایی این ویروس بکار گرفته شده است ((Pico et al.,1999.

اهمیت تولید گیاهان عاری از ویروس

روشهای متعددی برای کنترل بیماریهای ویروسی وجود دارد که همگی معطوف به پیشگیری از آلودگی هستند. زیرا نمی توان آنگونه که برای مبارزه با قارچها و باکتریها از قارچکش و یا باکتری کش استفاده می شود برای ویروسها نیز در سطح مزرعه ای و با صرفه اقتصادی استفاده شود. استراتژی های کلی کنترل بیماری های ویروسی تماماً پیشگیرانه و به منظور جلوگیری از آلوده شدن گیاه در مزرعه و یا استقرار ویروس در منطقه می باشند:

1.        ریشه کنی منبع آلودگی برای جلوگیری از دسترسی ویروس به محصول

2.        کاهش گسترش بیماری با کنترل ناقلین ویروس

3.        بکارگیری گیاهان سالم و کاشت بذور عاری از ویروس

4.        استفاده از گیاهان مقاوم به ویروس

کاشت بذر و نهال سالم یکی از اساسی ترین اقداماتی است که برای پیشگیری از بیماری های گیاهی به ویژه آلودگیهای ویروسی در مزرعه انجام می گیرد. این اقدام، به ویژه در مورد بیماریهای ویروسی که بذر زاد هستند حائز اهمیت بیشتری است. چرا که بذر می تواند مایه آلودگی اولیه برای بیماری باشد و پس از کاشته شدن در مزرعه، بیماری توسط ناقلین دیگر مثل حشرات به گیاهان سالم منتقل شده و تمام مزرعه را آلوده نماید. بنابراین جلوگیری از آلودگی توسط بذر آلوده در این نوع از بیماری ها می تواند در کاهش خسارت محصول و جلوگیری از آلودگی اولیه مؤثر باشد.

در برنامه های به نژادی گیاهان مختلف نیز مقایسه عملکرد ارقام اصلاح شده زمانی به واقعیت نزدیک تر خواهد بود که ارقام و لاین های مورد آزمایش عاری از ویروس باشند. از طرف دیگر در نگهداری و توزیع ژرم پلاسم گیاهان در بانکهای ژن نیز لازم است ژرم پلاسم نگهداری شده در کلکسیون های بانک ژن تماماً عاری از آلودگی باشند تا موجبات توزیع و گسترش آن به مناطق دیگر فراهم گردد.

در تمام موارد ذکر شده تکنیک های درمان گیاهان به منظور حذف ویروس و یا عامل آلودگی از آنها، روش های عاری سازی بذور و اندام های تکثیری دیگر و فرآیند های کشت بافت گیاهی با هدف تهیه گیاهان سالم و به دنبال آن به دست آوردن بذر سالم میتوانند به کمک محققین بیایند.

 

 

 

مقدمه ای بر ویروس ها

                                          محمد کاملی

قبل از هر چیز باید بدانیم که آیا ویروسها موجودات زنده محسوب می‌شوند یا نه. یک تعریف میگوید: حیات عبارت است از یکسری فرایندهای پیچیده حاصل از دستورالعملهای خاصی که بوسیله اسید نوکلئیک سلولهای زنده همواره در فعالیت می‌باشد. چون ویروسها در خارج از بدن میزبان به حالت خنثی بسر می‌برند به این مفهوم نمی‌توان آنها را موجود زنده در نظر گرفت. معهذا هنگامی که ویروسها وارد سلول میزبان می‌شوند اسیدهای نوکلئیک آنها فعال گشته و منجر به تکثیر ویروس می‌گردد. از نظر بالینی ویروسها را می‌توان موجودات زنده در نظر گرفت زیرا آنها مانند باکتریها ، قارچهای بیماریزا آلودگی و بیماری ایجاد می‌کنند. به ویروس کامل ویریون گفته می‌شود.

 

ساختمان شیمیایی ویروس

اسید نوکلئیک

یک ذره ویروسی دارای یک هسته مرکزی اسید نوکلئیکی DNA یا RNA به عنوان ماده ژنتیکی می‌باشد. نسبت اسید نوکلئیک به پروتئین غلاف ویروس از یک درصد در ویروس آنفلوانزا تا 50 درصد در برخی از باکتریوفاژها متغیر است. برخلاف سلولهای پروکاریوتیک و یوکاریوتیک که همواره دارای DNA به عنوان ماده ژنتیکی اصلی خود هستند ویروسها دارای یکی از دو نوع اسید نوکلئیک بوده و هرگز هر دو را باهم ندارد. اسید نوکلئیک در بعضی ویروسها به شکل خطی و در بعضی به شکل حلقوی می‌باشد.

 کپسید

اسید نوکلئیک ویروس بوسیله غلاف پروتئینی به نام کپسید احاطه شده است. کپسید ویروس که معماری آن بوسیله اسید نوکلئیک ویروسی تعیین می‌شود بخش عمده ویروس را بویژه در ویروسهای کوچک شامل می‌شود. هر کپسید از واحدهای کوچک پروتئینی به نام کپسومر ساخته شده است. نظم و ترتیب قرار گرفتن کپسومرها ، شکل کلی و پیکر ویروس را تعیین می‌کند که برای هر ویروس خاص ثابت است.

 

پوشش غیر پروتئینی

در عده‌ای از ویروسها کپسید بوسیله پوششی که معمولا ترکیبی از لیپیدها ، پروتئینها و کربوهیدراتها است پوشیده شده است.

 

 ویروسهای ناقص Defctive Virus

ویروسهای ناقص یا نارس از نظر عملکرد ویروسهایی هستند که از اسید نوکلئیک و پروتئین تشکیل شده‌اند، ولی بدون ویروس کمکی توان تکثیر ندارند. که به این ویروس کمکی Helper ویروس گفته می‌شود. ویروسهای ناقص در ساختمان ژنتیکی خود نقصی دارند و در خلال تکثیر در داخل سلول بوجود می‌آیند و چون این ویروسها می‌توانند تکثیر ویروسهای معمولی را مختل کنند تصور می‌شود که این ویروسها با تکثیر زیاد خود از تکثیر ویروسهای معمولی جلوگیری می‌کنند پس در بهبود بیماری نقش دارند.

 ویریون

به یک ذره ویروسی که توان آلوده کردن سلول را دارد گفته می‌شود. به ورود ویروس به داخل سلول عفونت یا آلودگی سلول گفته می‌شود که می‌تواند علایم بالینی داشته باشد یا نه.

 سودو ویریون

پارتیکولها یا ذرات ویروسی‌اند که به جای ژنوم ویروس تکه‌ای از ژنوم سلول میزبان به آن وارد شده است.

 ویروتید

از یک مولکول منفرد و حلقوی RNA تشکیل شده که معمولا پاتوژن گیاهان‌اند و فاقد کپسید و پوشش‌اند.

 

ویروسوئید

با وجود یک ویروس کمکی می‌توانند کپسید پروتئینی داشته باشند و در گیاهان از گیاهی به گیاه دیگر منتقل شوند.

 

ویروسهای گیاهی

ویروسها در جلبکها ، قارچها ، گلسنگها ، خزه‌ها ، سرخسها و گیاهان عالی دیده شده‌اند. ولی در گیاهان عالی بیش از گیاهان پست مورد مطالعه قرار گرفته‌اند. ویروسها به گیاهان زراعی خسارت عمده‌ای وارد می‌سازند. چون پاره‌ای از ویروسهای گیاهی چندان شباهتی با ویروسهای دیگر ندارند بنابراین گروه مستقلی را تشکیل می‌دهند. ولی بعضی از آنها دارای خصوصیات مشترک بوده و می‌توان آنها را در یک گروه قرار داد. این گروهها به شرح زیر هستند.

 

ویروسهای میله‌ای یا رشته‌ای

ویروسهای ایزو دیامتریک

ویروسهای باسیلی شکل

ویروئیدها: بیماریزاهایی شبیه ویروسها هستند که در میزبان خود نوکلئو پروتئین تولید نمی‌کنند.

ویروسهای جانوری

ویروس از انواع مختلف جانوران از تک یاختگان تا انسان جدا شده است. میزبان مهم ویروسها در بی‌مهره‌گان ، بندپایان هستند خصوصا کنه‌ها و حشرات. پاره‌ای از ویروسها در عین حال که در حشرات تکثیر می‌یابند می‌توانند در گیاه یا در جانور مولد بیماری باشند، ولی برای خود حشرات بیماریزا محسوب نمی‌شوند. ویروسها در اکثر مهره‌داران فعالیت دارند و در ماهیها ، دوزیستان ، پرندگان و پستانداران بیماریهایی تولید می‌کنند که گاهی علایم آنها به صورت تومور نمایان می‌شود. ویروسها در انسان نیز بیماریهای گوناگونی مانند اوریون ، سرخک ، تب زرد ، آبله ، آنفلوانزا و ... ایجاد می‌کنند.

 

تکثیر ویروسها

اسید نوکلئیک هر ویریون فقط تعداد معدودی از ژنهای لازم برای سنتز ویروسهای جدید را دارا می‌باشد. اکثر آنزیمهای ویروسها توسط سلول میزبان ساخته می‌شوند. نقش آنزیمهای ویروس تقریبا بطور کامل با همانند سازی و آماده کردن اسید نوکلئیک ویروسی ارتباط دارد و هرگز با دستگاه سنتز پروتئینی را تولید انرژی رابطه‌ای ندارد. مراحل 5 گانه تکثیر ویروس در سلول میزبان به صورت زیر است.

 

مرحله رونشینی ویروسها بر روی سلول

مرحله ورود و نفوذ در سلول

مرحله بیوسنتز اجزای ویروسی

مرحله رسیدن و کامل شدن ویروس

مرحله آزاد شدن ویروس از سلول میزبان و نفوذ آن در سلولهای سالم

رده بندی ویروسها از روی محل تاثیر آن بر روی میکرو ارگانیسمها

اندام تحت تاثیر ویروس نوع بیماری 

بیماریهای عمومی(بیماریهایی که در آن ویروسها از طریق خون و لنف به همه جای بدن منتقل می‌شوند.) آبله انسانی ، آبله گاوی ، سرخک ، سرخجه ، آبله مرغان و تب زرد 

سیستم عصبی آنسفالیت ، هاری و مننژیت 

سیستم تنفسی آنفلوانزا ، ذات‌الریه و برونشیت 

پوست و غشاهای مخاطی تبخال ، زگیل و زونا 

چشم انواع گوناگون ورم ملتحمه چشم 

کبد هپاتیت و تب زرد 

دستگاه گوارش ویروس A گاسترو آنتریت و ویروس B گاسترو آنتریت

 

شیمی درمانی علیه ویروسها

داروهایی که در مراحل مختلف تکثیر ویروسها در بدن میزبان اثر می‌کنند در تجربیات آزمایشگاهی موثر شناخته شده‌اند. ولی از نظر بالینی آمانتادین ، آسیکلوویر ، ویدارابین و تیو سمی کاربازون مفید شناخته شده‌اند. در اغلب بیماریهای ویروسی تکثیر ویروس تقریبا قبل از ظاهر شدن علایم بیماری پایان پذیرفته است. مساله دیگر پیدایش ویروسهای جهش یافته مقاوم نسبت به این داروها می‌باشد و کثرت وقوع آنها به اندازه باکتریها می‌باشد. شیمی درمانی علیه ویروسها در مراحل اولیه است و می‌توان در آینده داروهایی علیه ویروسها کشف کرد.

بيماري: كوتولگي زرد گندم

                                                          زینب کاشانی

مقدمه: كوتولكي زرد جو كه كوتولگي زرد نيز ناميده مي شود يك بيماري ويروسي است كه

اغلب در غلات رخ مي دهد و برگ جو را قرمز مي كند . در واشنگتن گاهي سبب كاهش بازده

محصول مي شود . شيوع بيماري اغلب در بخشهايي كه آبياري مي شوند و گندم زود كشت

ميگردد زياد است زيرا اين شرايط ، جمعيت شته ها را در طول تابستان حمايت مي كند .

بكاربردن آزمايش اليزا براي بيماري( (ELISA و يك آزمايش سرم شناسي ،

كشف و تشخيص بيماري را آسان ميكند .                                                                                         

عامل : ويروس عامل كوتولگي زرد غلات فقط بوسيله شته ها انتقال مي يابد و بطريق مكانيكي

يا با دانه منتقل نمي شود . هر چند 20گونه شته مختلف ، اين ويروس را منتقل مي كنند ولي

در واشنگتن فقط 5گونه شته غلات وجود دارد bird cherry)). در انگليس شته برگ غلات

وجود دارد . در روسيه شته گندم بدون ناقل پراكنده مي شود . ويروس كوتولگي زرد غلات ،

پايا بوده و توسط شته هاي ناقل انتشار مي يابد ولي بواسطه تخمهاي داخل تخمدان شته ها

منتقل نمي شود .

ويروس سواشده بايد بر طبق سرم شناسي و پاتولوژي (آسيب شناختي) و خويشاوندي

گروهبندي شود . گروه 1:MAV , PAV , SGV .گروه 2:RRV , RMV .

ويروس سواشده برطبق گونه هاي انتقال دهنده اختصاصي نيز نامگذاري مي شود :

PAV:Padio _avenae  (bird cherry _oat and English grain aphid)

در واشنگتن شرقي ، شته bird cherry بعنوان فراوانترين و موثرترين ناقل غيراختصاصي

ويروس كوتولگي زرد غلات مطرح شده است : PAV))

ميزبان :

 اغلب غلات و بيشتر علفها ميزبان ويروس كوتولگي زرد غلات هستند . ذرت يك

ميزبان بي نشانه است(حتي كمترين نشانه اي روي ذرت بصورت آشكار وجود ندارد) .

علامت و نشانه ها : نشانه كوتولگي زرد غلات با ميزبانهاي مختلف تغيير مي كند و محيط

زيست تاثير زيادي در اين نشانه ها دارد .اين بيماري معمولا بصورت لكه هايي در گياهان از

رشد بازمانده مزرعه ظاهر مي شود . برگهاي گياهاني كه تحت تاثير اين ويروس قرار مي

گيرند در مقايسه با  گياهان سالم كه برگهاي كشيده نوك تيز بطرف خارج دارند ، بسختي

بصورت راست و قائم قرار مي گيرند .

ممكن است رنگ برگ در گندم از زرد به قرمز يا ارغواني تغيير كند كه ظاهرا به موجودات ذره

بيني خاكهاي زراعي بستگي دارد . برگهاي غلات به رنگ زرد طلايي روشن و جودوسر به

رنگ قرمزارغواني درمي آيد . حالت بيرنگي كه اغلب خالدار است در برگ كشيده ظاهر مي

شود سپس در حاشيه برگ توسعه مي يابد و نتيجه آن زخمي شدن برگ مي باشد .

درجه حرارت ، حاصلخيزي ازت و تاثير نور از دلائل بيماري است . حرارت زياد ، نشانه هاي

مشخص و معلومي دارد . افزايش توليد ازت باعث افزايش رنگ گياه مي شود و نور زياد نيز

بررنگ تاثير مي گذارد . اين خالها ممكن است بصورت متناوب اتفاق بيافتد . هواي آفتابي و

مدت زمان آلودگي نيز نشانه هاي آشكاري را برجاي مي گذارد.

آلودگي ،خيلي زود سبب كوتولگي گياهان ، كم شدن جوانه ها ، بي برگي گياهچه ها،

 چروكيدگي  دانه و خسارت جدي و خطرناك مي شود .

 آلودگي كند و مزمن معمولا باعث سست شدن و بي رنگي برگ و كم شدن بازده محصول

مي شود .

چرخه بيماري :

 شته ها اين ويروس را از برخي منابع تغذيه اي مثل علفهاي وحشي و بيشتر

منابع گندم و جو يا ذرت بدست مي آورند . مدت زمان تغذيه از 30ــ12 ساعت ، بيشترين 

<