SDS-PAGE پروتئين ها

                                          http://www.iranbiotech.com

سديم دودسيل سولفات"SDS" يک دترجنت آنيوني است که به اغلب مولکولهاي پروتئيني در محلول هاي مايي و درpH  هاي متفاوت متصل مي شود. "SDS" تقريبا" به همه ي پروتئينها با نسبت تقريبي 4/1 گرم در 1 گرم پروتين اتصال مي يابد. براي همين "SDS"  باعث القاء بار الکتريکي منفي متناسب با اندازه در پلي پپتيدها ميگردد. علاوه بر اين "SDS" با تخريب پيوندهاي هيدروژني و بر هم کنش هاي هيدروفوبي, باعث تخريب ساختمان دوم و سوم پروتئين ها مي گردد. در صورت حضور يک ماده ي احيا کننده نظير "DTT"  پيوندهاي دي سولفيدي از گسسته وتاخوردگي پروتئين ها به طور کامل از بين مي رود. پلي پپتيدهايي که شکل طبيعي اشان توسط "SDS"  بر هم خورده و احيا هم شده اند به شکل ميله هايي انعطاف پذير در مي آيند که داراي بار منفي يک دست در واحد طول خود هستند. از آنجا که نسبت بار الکتريکي به جرم مولکولي در اين پلي پپتيدها تقريبا" نسبتي مشابه است, جداسازي پروتئين ها در الکتروفورز تحت چنين شرايطي تقريبا" به طور کامل وابسته به تفاوت در وزن مولکولي آنها است.

برخي پروتئين ها در "SDS-PAGE" رفتاري غيرعادي دارند به خصوص برخي گليكوپروتئين ها به مقادير عادي از "SDS" متصل نمي شوند, در نتيجه نسبت بار الکتريکي به وزن مولکولي در آنها مشابه اين نسبت در پروتئين هاي ديگر نيست و مهاجرت آنها کمتر بوده در نتيجه وزن مولکولي بيشتري از خود نشان خواهند داد.

پروتئين هايي با بارمنفي زياد و يا با  بار مثبت زياد, مثلا" هيستون ها, يا پروتئين هاي غني از پرولين, مثلا" كلاژن, در مجاورت "SDS" بطور غيرطبيعي وزن مولکولي بالايي از خود نشان مي دهند.

ّبه هرحال، "SDS-PAGE" در جداسازي پروتئين هايي با جرم مولكولي خيلي مشابه كه داراي تغييرات بعد از ترجمه, نظير استيليشن يا متيليشن يا فسفروريليشن, هستند از ارزش کمي برخوردار است. براي آناليز چنين پروتئين هاي تغيير يافته اي ، از روش PAGE با اوريک اسيد استفاده مي شود كه در آن هم وزن مولكولي و هم بار پروتئين در فرآيند جداسازي دخيل است . پروتئين در pH اسيدي بار مثبت دارد و در ميدان الكتريكي به سمت كاتد حركت مي كند . به اين دليل از روش PAGE اسيداوره عموماً براي جداسازي پروتئين هايي با سايز يكسان و بار متفاوت استفاده مي شود.

 

مشكلاتي كه ممكن است درحين آماده سازي و كار با ژلSDS بوجود آيد:

 

 

مشكل	علت	چارة كار
كاهش ميزان پليمريزاسيون ژل	وجود اكسيژن ، كهنه بودن محلولهاي استوک  ( بخصوص آكريل آميد و امونيوم پرسولفات )	محلولها را degas كنيد. مجدداً محلول استوک تهيه كنيد .
تشكيل انتهاي چسبنده ژل	نفوذ n-butanol به ژل.	محلول ژل را با n- بوتانل بپوشانيد بدون اينكه مخلوطشان كنيد .
نارضايتي از نتيجه رنگ آميزي، رنگ آميزي ضعيف	رنگ بطور مطلوب باند با نمونه نشده است	از محلول غليظ تر رنگ استفاده كنيد . زمان رنگ‌آميزي را افزايش دهيد و يا از رنگي با حساسيت بالا استفاده كنيد. محلول رنگي مي بايستي حاوي محلول ارگانيك ( مثل متانول ) باشد كه SDS را از پروتئين جدا كند چراكه ممكن است رنگ به آن بچسبد .
رنگ يكدست نيست	نقوذ رنگ و يا رنگ بري بصورت يكدست انجام نشده است .	ژل را درطي رنگ آميزي و رنگ بري تكان دهيد . زمان رنگ آميزي و رنگ بري را افزايش دهيد .
باندها رنگ نگرفته اند .	رنگ پروتئين حذف شده است.	ژل را مجدداً رنگ كنيد . زمان رنگ بري را كم كنيد و يا از رنگي استفاده كنيد كه پروتئين را طوري رنگ كند كه رنگش محو نشود ..
بر روي ژل نشانه هايي از رنگ در نواحي غيراختصاصي مشاهده مي شود	درمحلول رنگي ، رنگ به صورت جامد و حل نشده باقي مانده و مشاهده  مي شود .	از حل شدن كامل رنگ اطمينان حاصل كرده يا اينكه رنگ را پيش از استفاده فيلتر كنيد .
آلودگي بطور وضوح مشاهده مي شود .	وسايل و يا محلولهاي استوک آلوده هستند . مواد غيرپروتئيني در نمونه رنگ گرفته اند ( به عنوان مثال اسيدنوكلئيك )	وسايل را تميز كرده يا از وسايل نو استفاده كنيد. از رنگ ديگري استفاده كنيد كه آلودگي ها را رنگ ننمايد .
تفكيك باندهاي پروتئيني بخوبي انجام نگرفته است .	الكتروفورز ناكارآمد . سايز Pore (‌حفره ) ژل جداكننده مناسب نيست . ميزان load شده تا ميزان زيادي عوض شده است	درصد C و T ژل جداكننده را تغيير دهيد . هربار از ميزان Loading يكساني استفاده كنيد .
هر از گاهي تغييرات جزئي درحركت الكتروفورتيك پروتئينهاي استاندارد مشاهده مي شود .	اجزاء سازنده ژل به لحاظ كيفي از Batch به Batch ديگر با گذشت زمان تغيير مي كند .	از يك Batch ماده شيميايي تا حداكثر زمان ممكن استفاده كنيد و محلولهاي Stock دترجنت هاي كهنه را عوض كنيد .
كج و معوج شدن باندها ، باندها پخش يا رگه دار شده باشد .	پروتئينهاي نمونه در حلال غيرقابل حلند ، يا بصورت مجتمع aggregate باقي مانده اند . يك عامل حل نشده است يا حباب موجود در ژل با باند پروتئيني درحال حركت درگير شده است .	از حلال تازه با SDS اضافي و عوامل كاهنده  استفاده كنيد بخصوص براي محلولهاي مربوط به نمونه تغليظ شده . محلول Stock را پيش از استفاده فيلتر كنيد و هرگونه حبابي را از ژل خارج كنيد .
مهاجرت پروتئيني يكپارچه نيست ( باندها خم مي شوند )	سايز حفرات ژل يكسان نيست . بخشي از ژل درگير نشده است . نشت الكتريكي (برق دزدي). خنك كردن ژل يكپارچه نيست ( در نتيجه يك بخش سريعتر از بخش ديگر حركت مي كند ) .	مطمئن شويد كه محلولهاي ژلي بخوبي مخلوط شده اند و پليمريزاسيون خيلي به سرعت انجام گرفته ( براي كاهش زمان پليمريزاسيون پرسولفات را كاهش دهيد . قبل از الكتروفورز هر حبابي را كه به ژل چسبيده حذف كنيد . مطمئن شويد كه اسپيسهاي كناري درجاي مناسب قرارگرفته اند . سيستم خنك كننده ژل را بهبود بخشيد يا ميزان گرما را با كاهش ولتاژ يا قدرت يوني بافر كاهش دهيد .

  

 

 

مباني الکتروفورز

                                             http://www.iranbiotech.com

الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان شبکه اي متخلخل حركت مي کنند. سرعت حرکت مولکولها در اين شرايط نه تنهاتحت تاثير بار الکتريکي اشان است بلکه عواملي ديگري نظير اندازه و شکل مولکول نيز در اين امر دخيل هستند. به همين دليل الکتروفورز روشي مناسب و کارآمد در جداسازي مولکول مورد استفاده قرار مي گيرد. معمولا" الکتروفورز براي جداسازي مولکولهاي بزرگي چون پروتئين ها و اسيدهاي نوکلئيک به کار برده مي شود, اما در مواردي نيز براي جداسازي مولکولهاي باردار کوچکتري نظير قندها, اسيدهاي آمينه, پپتيدها و حتي يونهاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد.

معمولا" براي الکتروفورز يک مخلوط مولکولي, لايه نازکي از آن, بر روي شبکه اي متخلخل که محلولي را درون خود محبوس کرده است, قرار داده مي شود. پس از برقراي ميدان الکتريکي با اِعمال اختلاف پتانسيل در دو سوي اين شبکه, مولکولهاي موجود در نمونه با سرعت هاي متفاوتي درون شبکه متخلخل شروع به حرکت مي کنند. اين اختلاف سرعت مبناي جداسازي در الکتروفورز است. در پايان, مولکولهاي پروتئيني مختلف به صورت باند هايي مجزا در قسمت هاي مختلف شبکه آشکار مي شوند. شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکولها در اثر گرماي ايجاد شده به خاطر جريان الکتريکي نقش مهمي دارد. علاوه بر اين در مواردي که از ژل هاي آگاروز و پلي آکريل آميد استفاده مي شود, شبکه متخلخل نقش يک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکولها را نيز ايفا مي کند.

در اغلب دستگا ه هاي الکتروفورز, ژل مابين دو محفظه ي بافري قرار مي گيرد به طوريکه ژل تنها واسطه در عبور جريان الکتريسيته بين اين دو محفظه باشد (شکل 5-1).

شکل 5-1- شمايي از سيستم الکتروفورز

جداسازي توسط الکتروفورز تحت تاثير عوامل متعددي قرار دارد. ماهيت مولکولهاي نمونه نظير بار الکتريکي و اندازه آنها و شدت جريان و ميدان الکتريکي و بالاخره اثرات محيطي نظير نوع و نحوه ي استفاده از بافرها و حرارت ايجاد شده در حين کار عواملي هستند که بر نحوه ي جداسازي مولکولهاي نمونه اثر مي گذارند.

5-1-1-1-  اثر عوامل الکتريکي

در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول ها تناسب مستقيم با اختلاف پتانسيل اِعمال شده دارد. قانون اُهم  Ohm در الکتروفورز از اهميت زيادي برخوردار است (معادله 5-1)

V=IR

معادله 5-1- قانون اهم؛ V ولتاژ يا اختلاف پتانسيل برحسب ولت, I شدت جريان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است

معادله فيزيکي ديگر که از آهميت برخوردار است, معادله توان است. اين معادله مقدار حرارت ايجاد شده در حين الکتروفورز را مشخص مي کند.

P=V²/R يا P=I²R يا P=VI

معادله 5-2- معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است.

اين حرارت ايجاد شده بر اثر مقاومتي است که الکترودها, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرماي ژول Joule heat موسوم است. منابع الکتريکي Power supply مورد استفاده در الکتروفورز ايجاد جريان مستقيم مي کنند و معمولا" يکي از پارامترهاي الکتريکي,يعني ياجريان يا اختلاف پتاتسيل يا توان را ثابت نگاه مي دارند. بايد توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده در الکتروفورز را به هر حال نمي توان ثابت نگاه داشت. براي مثال در حين الکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرماي ژول, کاهش مي يابد. بنا بر نوع بافر بکار رفته و پارامتر الکتريکي که ثابت نگاه داشته مي شود, گرماي ژول در حين انجام الکتروفورز ممکن است کاهش يا افزايش يابد (جدول 5-1). براي مثال در "SDS-PAGE" ناپيوسته ثابت نگاه داشتن شدت جريان منجر به افزايش دما مي شود که نياز به سيستم خنک کننده را در چنين وضعيتي الزامي مي کند.

جدول 5-1- تاٍثير ثابت نگاه داشتن پارامترهاي الکتريکي در سيستم هاي بافري مختلف

 

انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز, با در نظر گرفتن متغير هاي مختلفي صورت مي پذيرد. براي مثال مدت زمان مورد نظر براي انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ مي دهد, و نياز به حفظ دماي خاص براي انجام الکتروفورز. معمولا" پروتئين ها با جريان ثابت الکتروفورز مي شوند, در حاليکه الکتروفورز اسيد هاي نوکلئيک با ولتاژ ثابت انجام مي شود.

5-1-1-1- اثر سيستم هاي بافري و pH

پروتئين ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH  محيطي که در آن قرار داشته باشند بارالکتريکي خاص خود را نشان مي دهند. بدين ترتيب در جداسازي توسط الکتروفورز بايد pH  محلول هاي  مورد استفاده ثابت باقي بماند از آنجا که الکتروليز آب در آنود يونهاي "H⁺" و در کاتود يونهاي "OH^-" ايجاد مي کند, براي ثابت نگاه داشتن pH محلولهاي مورد استفاده, آنها بايد بافر شوند.

5-1-1-2- اثر حرارت

براي حفظ تکرار پذيري, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مهم است. براي مثال پلي مريزه شدن آکريل آميد يک واکنش گرمازا است, از اينرو گرماي ايجاد شده در حين پلي مريزاسيون, به خصوص در مورد ژل هاي غليظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بي نظمي در اندازه ي منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولا" مشکلي در ژل هايي با غلظت کمتر از 15% T نمي کند. به هر حال گرماي زياد در حينالکتروفورز مشکلات ديگري را نيز پديد مي آورد؛ شکستن شيشه هاي الکتروفورز, آسيب به دستگاه. وقتيکه حرارت بصورت يک دست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهاي جدا شده نامنظم » شود و در اصطلاح باندها خندان مي شوند چون نمونه ها در رديف هاي وسط سريع تر از رديف هاي کناري حرکت خواهند کرد.

5-2-      الکتروفورز با ژل پلي آکريل آميد

اكثر روش هاي مربوط به تفكيك پروتئين ها كه امروزه از آنها استفاده مي شود بر مبناي الكتروفورز منطقه اي يا ناپيوسته ژل هاي پلي آكريل آميد استوار است . الكتروفورز منطقه اي  روي ژل پلي آكريل آميد تحت عنوان "PAGE" شناخته مي شود. در اين روش از تفاوت وزن مولكولي و بارالکتريکي پروتئين ها به طور همزمان براي تفکيک آنها از يکديگر استفاده مي شود.

اساس اين روش بر مبناي حركت مولکولهاي باردار در يك ميدان الكتريكي مشخص است. مشخصات ميدان الکتريکي نظير اختلاف پتانسيل، فاصلة بين الكترودها ، مشخصات مولکول نظير بار الکتريکي, اندازه و شكل مولكول ، و عوامل ديگري نظير دما و زمان بر نحوه ي انجام اين روش تاثير مي گذارند.

درسيستم ناپيوسته "Laemmli" دو نوع ژل وجود دارد: ژل رديف کننده و ژل تفکيک کننده Resolving  ژل رديف کننده ژلي با طول کم و با منافذ بزرگ است كه در بالاي ژل بلند و با منافذ كوچك تفکيک کننده قرار مي گيرد. در سيستم "Laemmli" ژلهاي رديف کننده و تفکيک کننده با تو جه به تركيب بافريشان نيز ناپيوسته اند.

اين دو پارامتر ; بافرهاي متفاوت و تركيب آكريل آميد متفاوت به نمونه هايي با حجم نسبتاً بزرگ اين اجازه را مي دهد كه در بخش بالاي ژل رديف کننده متمركز شوند پيش از آنكه بواسطة ورود به ژل پائيني تفکيک کننده عمل جداسازي رويشان انجام گيرد.

مزيت مهم ژل رديف کننده توانايي آن در تمركز پروتئين نمونه هاي بسيار رقيق است . اين كار بطور مؤثري تفكيك مراحل بعدي را بهبود مي بخشد چراكه نمونة اصلي در ناحية خيلي باريك و بسيار متمركزي جمع مي شود و همة مولكولهاي پروتئيني جداسازي الكتروفورتيك خود را تقريباً از يك نقطه شروع مي كنند.

رديف شدن  ناشي از ايجاد يك گراديان محدودو با ولتاژ بالا است كه در آن پروتئين ها مقيد به يك ناحية باريك كاملاً متمركز بين يونهاي كلرايد پيشتاز و گلايسين دنباله رو مي شوند. وقتي جريان الكتريكي از نمونه عبور مي كند، يون كرايد از ساير يونها كه حركت آرامتري دارند ( مثلاً گلايسين ) سريعتر مهاجرت مي كند. يون هاي نمونه با حركت حد واسط خود بين يونهاي كلريد و گلايسين كمپرس شده و در نتيجه  يك ناحية باريك يا باندي شكل بسيار متمركز ايجاد مي شود. بنابراين ژل رديف کننده قادر است  پروتئين ها را بصورت باندي باريك ساندويچ كند. براي انجام جداسازي الكتروفورتيك، پروتئين ها بعد از انباشته شدن روي يكديگر از آن محدوده جدا شوند. تفكيك بدون رديف کردن و با با افزايش ناگهاني pH و كاهش قطرحفرات ژل نيز امكان پذير است . تحت اين شرايط ، يونهاي نمونه به ژل تفکيک كننده مهاجرت كرده و يونهاي عقب دنباله رو ( گلايسين ) متناوباً از يونهاي نمونه پيشي گرفته و جلو مي زنند. بنابراين گراديان ولتاژ نسبتاً ثابتي ايجاد مي شود كه در آن جداسازي الكتروفورتيك نمونه رخ مي دهد.

5-2-1-     نحوه ي ايجاد منافذ با اندازه هاي متفاوت

ژل پلي آكريل آميد محدودة گسترده اي از اندازه هاي حفرات ژلي را دربر مي گيرد .

 

ژل پلي آكريل آميد با پليمريزاسيون آكريل آميد مونومريك و مونومر ايجاد كنندة پيوند متقاطع  Cross linker, بيس آکريل آميد شكل مي گيرند( شکل 5-2).

 

شکل 5-2- نحوه ي پلي مريزاسيون آکريل آميد

پليمريزاسيون آكريل آميد و بيس آكريل آميد مي تواند به صورت شيميايي, با  تترامتيل اتيلن ديامين N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) و آمونيوم پرسولفات, يا سيستم فتوشيميايي باشد.

راديكالهاي آزاد پرسولفات كه با حل آمونيوم پرسولفات در آب ايجاد مي شوند مونومر آكريل آميد را فعال كرده و "TEMED" در اين واكنش با انتقال الكترون اين واكنش را كاتاليز مي كند . در عين حال ريبوفلاوين مي تواند در حضور اكسيژن و اشعة UV راديكال آزاد توليد كند . بعضي مواقع از ريبوفلاوين و آمونيوم پرسولفات براي ايجاد راديكالهاي آزاد استفاده مي شود.

اندازة منافذ ژل عامل اصلي در تعيين قدرت تفكيك پروتئين ها و پلي پپتيدها در ژلهاي پلي آكريل آميد است. اندازه ي منافذ با دو پارامتر مشخص مي شوند: محتواي کل ماده ي جامد يا %T ونسبت مونومر ايجاد کننده ي پيوند متقاطع به مونومر آکريل آميد يا %C.

 

شکل 5-3- تعيين %T و %C در ژلهاي پلي آکريل آميد

بدين ترتيب پليمرهاي آكريل آميد مي توانند منافذي با اندازه هاي بسيار متفاوتي را ايجاد کنند. با تغيير در غلظت آكريل آميد و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه ي منافذ امکان پذير است. براي مثال، با افزايش نسبت پيوندهاي متقاطع ، اندازه ي منافذ كاهش مي يابد. انتخاب دقيق و درست غلظت ژل آكريل آميد براي جداسازي بهينه پروتئين ها در الكتروفورز ضروري است(جدول 5-2(.

محدوده اندازه ي مولکولي قابل تفکيک (kD)	درصد آکريل آميد در ژل
205-36	5%
205-24	5/7%
205-14	10%
66-14	12%
45-14	15%

جدول 5-2- در صد آکريل آميد براي جداساژط پروتئين هايي با اندازه هاي مختلف

نکات ديگري نيز در نحوه ي پلي مريزه شدن موثرند, براي مثال با افزايش دماي پليمريزاسيون، ميزان پليمريزاسيون افزايش مي يابدو اندازه ي منافذ ژل كوچك مي شود. درحاليكه كاهش دماي پليمريزاسيون مي تواند ژلهايي با منافذ بزرگ توليد كند. عواملي كه كارايي تبديل مونومر به پلي مر را تحت تأثير قرار مي دهند نيز مي توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثير قرار دهند. براي مثال ، استفاده از آكريل آميد كيفيت پائين و نيز pH بسيار بالا يا پايين سبب تبديل ناكامل مونومر به پلي مر شده و سبب ايجاد منافذ بزرگي در ژل شود. مواد افزودني ژل نيز مي تواند بطور قابل توجهي ساختار منافذ ژل را تحت تأثير قرار دهدمثلاً اوره 8 مولار سبب ايجاد ژلهايي با منافذ کوچک مي شود, چون سبب تسهيل پليمريزاسيون كامل مي شود.

 

SDS-PAGE

سيستم بافري ناپيوسته Non continous  كه توسط "Laemmmli" در سال 1970 معرفي شد، رايج ترين روشي است كه براي بعد دوم الكتروفورز دوبعدي بكارگرفته مي شود. ژلها يا داراي غلظتي مشخص از پلي آكريلاميد يا حاوي شيبهاي غلظتي از پلي آكريلاميد هستند. نوارهاي "IPG" بعد از متعادل سازي مستقيماً بر سطح ژلهاي بعد دوم "SDS-PAGE" قرار داده مي شوند كه اين ژلها مي توانند عمودي يا افقي باشند.

در مورد روشهايي كه از سيستم هاي افقي براي بعد دوم استفاده مي شود اين مزيت وجود دارد كه چون  ژلهاي "SDS-PAGE" بر روي يک صفحه ي پلاستيكي متصل هستند, در نتيجه از تغييرات در اندازة ژل در حين رنگ‌آميزي ممانعت بعمل مي آيد. در روش افقي نقاط در مقايسه با آن چيزي كه از سيستم عمودي گرفته مي شود داراي وضوح بيشتري هستند. اين امر به دليل قطر کمتر ژلها مي باشد كه معمولاً در سيستم افقي 5/0 ميلي متر است درحاليكه در سيستم عمودي بين 5/1-1 ميلي متر است. قطر کم استفاده از ولتاژهاي بالاتر را ممکن مي سازد و درنتيجه انتشار پروتئينها در حين الکتروفورز كمتر است. اما مزيت ژلهاي "SDS-PAGE" عمودي در امکان انجام چندين تجربه به طور هم زمان است که درآناليز پروتئوم کمک به افزايش تكرارپذيري نمايه ي پروتئيني الكتروفورز دوبعدي را مي نمايد. در سيستم هاي عمودي نياز به استفاده از ژلهاي رديف کننده Stacking نيست زيرا مناطقي كه پروتئينها در آن فوكوس شده اند در داخل نوارهاي IPG قبلاً تغليظ شده‌اند.

"SDS-PAGE" علاوه بر استفاده گسترده در الکتروفورز دو بعدي, يكي از قابل اعتمادترين روشهاي موجود براي جداسازي پروتئين در مخلوط هاي پروتئيني و نيز ارزيابي خلوص پروتئين است. كاربردهاي ديگر "SDS-PAGE" كه در تحقيقات مربوط به تعيين ساختار پروتئين و پروتئوميكس مطرح مي شود عبارتند از:

• تعيين جرم مولكولي نسبي (Mr)

• مشخص كردن غلظت پروتئين

• شناسايي تغييرات پروتئين

• تعيين نقشه پپتيدي با استفاده از هضم پروتئوليتيك جزئي در ژل رديف کننده.

• مرحلة اول ايمونوبلاتينگ با انتقال الكتروفورتيك به ماتريكس

• تلفيق با روشهاي پروتئوليتيك با توان عملكردي بالا براي توالي يابي  مستقيم پايانه هاي كربوكسي ـ آميني و يا تلفيق هضم پروتئوليتيك بر روي ژل و اسپكتروفوتومتري جرمي براي تعيين هويت پروتئين است.

اگرچه اكثر محققان هنوز از روش تكنيك هاي رنگ آميزي كوماسي  برليانت بلو ،‌ نيترات نقره و همچنين برچسب هاي راديواکتيو استفاده مي كنند، استفاده از روشهاي پيشرفته جديد با حساسيت بالا در بصري سازي پروتئين بخصوص روشهاي رنگ آميزي فلورسانس ، حساسيت كلي آشكارسازي پروتئين ها را در روي ژل پلي آكريل آميد بالا برده است.

تکنیک های تصویربرداری برای نشان دادن سلامت گیاه

                                               فاخته سوخت سرایی

ازنظر تاريخي اولين تغييرات القاء شده توسط تنش ها در گیاهان پس ازتغییرات تخریبی نمونه های گیاهی که بدنبال تغییرات شیمیایی و مولکولی صورت می گیرد،قابل تشخیص بوده است.تکنیک های تصویربرداری که اجازه می دهند تغییرات ناشی از تنش ها راقبل از ظهور علائم آن،تشخیص دهند و قبل از تثبیت آنها بتوانند تغییرات لازم را اعمال کنند،به عنوان ابزاری مناسب جهت مدیریت بهینه محصولات کشاورزی مطرح شده است.چنین وسایل و ابزاری که برای مشاهده ی این تغییرات ساخته شده اند،می توانند جمعیت های گیاهی را از نظر موتان هایی (جهش یافته هایی) که نسبت به تنش ها تحمل بیشتری دارند،نشان دهند.در مقیاس آزمایشگاهی،روش های مختلف و متنوع تصویربرداری می تواند بررسی شده و یک یا چند روش ترکیبی مناسب برای مراقبت از محصولات برگزیده، انتخاب شود.سیستم انتخاب تحت شرایط کنترل شده آزمایشگاهی انتخاب شده و برای نمونه برداری های لازم جهت کارهای مولکولی و تغییرات سریع القاء شده توسط تنش ها بکار رود.چنین روشی تا بتوانیم ژن های القاءکننده ی  علائم اولیه و مقدماتی را جدا کنیم و یا یک تصویر وسیع و واضح از بیان زودرس ژن ها در هنگامیکه گیاهان تحت اثر تغییرات فیزیولوژیکی قرار می گیرند،بدست آوریم.البته چون این تغییرات با چشم انسان قابل مشاهده نیستند،با کمک تکنیک های سنجش ژنی می توانیم این تغییرات را متوجه شویم.نتیجه ی این تحقیقات اینست که گیاهانی را بدست آوریم که نسبت به تنش های بیشتری مقاوم باشند. با پیشرفت های جدید در زمینه ی شناسایی ژنوم،ژنوم هایی که نقش آنها نامشخص است،خیلی سریعتر در مسیر شناخت واقع می شوند.به وسیله ی ردگیری تغییرات(مشاهده تغییرات) در فنوتیپ گیاهان تراریخته(تغییریافته ژنتیکی) که ژنهای فوق در آنها بیان شده است،تکنیک های تصویربرداری می توانند کمک مؤثری به تشخیص عملکرد و نقش این ژن ها نماید.

استفاده از فن كشت بافت به منظور تكثير انبوه گياهان عاري از بيماري

                                         الهام همزه پور

از فن كشت بافت براي توليد تجاري گياهان عاري از پاتو‍‍‍‍‍‍‍‍‍ژن و به منظور حفاظت از گياهان كمياب و در حال انقراض استفاده ميشود.در اين روش از تكنيك هايي مثل كشت مريستم و ريز نمونه ها در محيط آزمايشگاهي (درون شيشه)استفاده مي شود.گياه Anoectochilus formosanus يك گياه دارويي چند ساله ي كند رشد و بومي تايوان كه بوسيله ي بذر تكثير مي شود ولي نشاهاي آن حدود 3-2 سال طول مي كشد تا بالغ شوند و توليد بذر كنند. استفاده از گونه هاي اين گياه براي تكثير به علت حساسيت فوق العاده زيادآن به پوسيدگي ساقه و ريزوم قارچ Fusarium oxysporum كاري مشكل است.هم اكنون روشهايي به منظور توليد انبوه اين گياه در شيشه با استفاده از جوانه راسي و ريز نمونه ي گرهي معرفي شده است.در اين روش از گياهان 2 ساله ي سالم به عنوان منبع توليد ريزنمونه استفاده مي شود.زماني كه گياه جوان حدود 4-2 سانتي متر رشد كرد در محيط كشت مايع حاوي BAوNAA قرار داده مي شود و بعد از 2 ماه كشت،جوانه هاي محوري شروع به رشد كرده و ريشه دارمي شوند و آنها را دوباره در محيط كشت ديگري كشت داده و به مدت 2 ماه محافظت شده، با رشدمناسب ريزوم ها،آنها را با آب شسير شسته و بعد به سبد هاي پلاستيكي حاوي پيت ماس انتقال مي دهند.بيش از 95% گياهان بعد از كاشته شدن در گلدان سالم جان سالم به در بردند.از اين روش در تايوان به منظور توليد تجاري گياهان عاري از بيماري استفاده مي شود.

كشت گياه چند ساله ي( (Limonium wrightii

L.wrightii يك گياه علفي چند ساله كه در جزاير ژاپن و قسمت هاي جنوبي تايوان يافت مي شود.توليد انبوه اين گياه ظرف مدت كوتاه با استفاده از بذر به دليل اينكه اين گياه فقط در پاييز به گل مي رود و نهال بدست آمده از بذر داراي قدرت جوانه زني خيلي ضعيف مي باشد،غير ممكن است.يك روش تكثير سريع اين گياه در شيشه با استفاده از جوانه راسي و پايه برگي است.در اين روش برگها از جزيره Lotao جمع آوري و در Growth chamber پرورش داده شدند.بعد برگهاي اين گياه را برداشته و ضد عفوني كرده ودر محيط كشت حاويNAA وBA به مدت 2 ماه كشت داده شد.در اين مدت جوانه هاي نا بجا روي پايه برگي تشكيل شدند.اين جوانه هاي نا بجا در محيط كشت ديگري تكثير و به سادگي در محيط كشت پايه ريشه دار شدند.نهال هاي ايجاد شده از اين جوانه ها مي توانند 8 نهال توليد كنند.

توليد غده هاي دارويي(Corydalis yanhusuo)

از غده هاي خشك اين گياه در ژاپن و چين در طب سنتي استفاده مسي شود.حساسيت بالاي اين گياه به سفيدك داخلي با عامل  Prenospora  corydalis امكان تكثير انبوه آن را دچار مشكل كرده است.بذز هاي اين گياه به دليل نارس بودن سرعت جوانه زني پاييني دارند و رشد نشاي اين گياه هم بسيار كند است واين گياه در سال اول فقط يك غده ي نارس كوچك تشكيل مي دهد،ولي با استفاده از كالوس مي توان در مدت زمان كوتاه اين گياه را در سطح وسيع كشت داد.

روش رنگ آميزی کوماسی کلوئيدی

در سال 1985 Neuhoff روشی حساس برای رنگ آميزی پروتئين در ژلهای آکريلاميد بر پاية ويژگی کلوئيدی آبی کوماسی G-250 ارائه کرد. اين روش درکمتر از يک ساعت پروتئين ها را در يک زمينه تميز و با حساسيتی درحدود روش نقره رنگ آميزی می کند. اين روش بعداً توسط همان گروه بهبود يافت.

افزودن متانل و سولفات آمونيوم به محلولی از آبی کوماسی G-250 در اسيد فسفريک رقيق، رنگ مذکور را به سمت شکل کلوئيدی آن سوق می دهد. در طی رنگ آميزی، تعادلی بين اشکال کلوئيدی وفرم پراکنده مولکولی رنگ وجود دارد. فرم پراکنده رنگ وارد ماتريکس ژل می شود و پروتئين ها را رنگ می کند. حال آنکه فرم کلوئيدی بيرون نگه داشته می شود و به اين ترتيب از رنگ آميزی زمينه پرهيز می شود.

پروتکل های متعددی برای رنگ آميزی با کوماسی و نيز تعداد مختلفی رنگ کوماسی وجود دارد. اين روشها سريع و ارزان هستند هرچند که مرحله تهيه رنگ می تواند اندکی همراه با آلودگی با رنگ باشد. بهتر است محلول رنگ را به فواصل زمانی مشخصی تجديد کرد چون رنگ کهنه حساسيت خود را از دست می دهد. همچنين می توان محلولهای آماده رنگ را البته با قيمت بيشتر خريداری کرد. اغلب شرکتهايی که اين رنگها را توليد می کنند ادعا می کنند که اين رنگها از رنگهای کوماسی مرسوم حساستر هستند و رنگ زدايی کمتر احتياج دارند و بعلاوه ، مواد غير پروتئينی از جمله پلی ساکاريدها را هم رنگ می کند.

تمام مراحل کار روی يک  شيکر چرخان با دور ملايم انجام می شوند. بدنبال الکتروفورز، ژل را در محلول رنگ کوماسی کلوئيدی قرار می گيرد. محلول رنگ را پيش از استفاده نبايد صاف کرد. ژل حدود 6 ساعت يا شب تا صبح درمحلول رنگ قرار داده می شود. در انتها ژل چندين بار با آب مقطر شسته می شود تا زمينة ژل شفاف شود .

مشكلاتي كه ممكن است درحين آماده سازي و كار با ژلSDS بوجود آيد:

مشكل	علت	چارة كار
كاهش ميزان پليمريزاسيون ژل	وجود اكسيژن ، كهنه بودن محلولهاي استوک  ( بخصوص آكريل آميد و امونيوم پرسولفات )	محلولها را degas كنيد. مجدداً محلول استوک تهيه كنيد .
تشكيل انتهاي چسبنده ژل	نفوذ n-butanol به ژل.	محلول ژل را با n- بوتانل بپوشانيد بدون اينكه مخلوطشان كنيد .
نارضايتي از نتيجه رنگ آميزي، رنگ آميزي ضعيف	رنگ بطور مطلوب باند با نمونه نشده است	از محلول غليظ تر رنگ استفاده كنيد . زمان رنگ‌آميزي را افزايش دهيد و يا از رنگي با حساسيت بالا استفاده كنيد. محلول رنگي مي بايستي حاوي محلول ارگانيك ( مثل متانول ) باشد كه SDS را از پروتئين جدا كند چراكه ممكن است رنگ به آن بچسبد .
رنگ يكدست نيست	نقوذ رنگ و يا رنگ بري بصورت يكدست انجام نشده است .	ژل را درطي رنگ آميزي و رنگ بري تكان دهيد . زمان رنگ آميزي و رنگ بري را افزايش دهيد .
باندها رنگ نگرفته اند .	رنگ پروتئين حذف شده است.	ژل را مجدداً رنگ كنيد . زمان رنگ بري را كم كنيد و يا از رنگي استفاده كنيد كه پروتئين را طوري رنگ كند كه رنگش محو نشود ..
بر روي ژل نشانه هايي از رنگ در نواحي غيراختصاصي مشاهده مي شود	درمحلول رنگي ، رنگ به صورت جامد و حل نشده باقي مانده و مشاهده  مي شود .	از حل شدن كامل رنگ اطمينان حاصل كرده يا اينكه رنگ را پيش از استفاده فيلتر كنيد .
آلودگي بطور وضوح مشاهده مي شود .	وسايل و يا محلولهاي استوک آلوده هستند . مواد غيرپروتئيني در نمونه رنگ گرفته اند ( به عنوان مثال اسيدنوكلئيك )	وسايل را تميز كرده يا از وسايل نو استفاده كنيد. از رنگ ديگري استفاده كنيد كه آلودگي ها را رنگ ننمايد .
تفكيك باندهاي پروتئيني بخوبي انجام نگرفته است .	الكتروفورز ناكارآمد . سايز Pore (‌حفره ) ژل جداكننده مناسب نيست . ميزان load شده تا ميزان زيادي عوض شده است	درصد C و T ژل جداكننده را تغيير دهيد . هربار از ميزان Loading يكساني استفاده كنيد .
هر از گاهي تغييرات جزئي درحركت الكتروفورتيك پروتئينهاي استاندارد مشاهده مي شود .	اجزاء سازنده ژل به لحاظ كيفي از Batch به Batch ديگر با گذشت زمان تغيير مي كند .	از يك Batch ماده شيميايي تا حداكثر زمان ممكن استفاده كنيد و محلولهاي Stock دترجنت هاي كهنه را عوض كنيد .
كج و معوج شدن باندها ، باندها پخش يا رگه دار شده باشد .	پروتئينهاي نمونه در حلال غيرقابل حلند ، يا بصورت مجتمع aggregate باقي مانده اند . يك عامل حل نشده است يا حباب موجود در ژل با باند پروتئيني درحال حركت درگير شده است .	از حلال تازه با SDS اضافي و عوامل كاهنده  استفاده كنيد بخصوص براي محلولهاي مربوط به نمونه تغليظ شده . محلول Stock را پيش از استفاده فيلتر كنيد و هرگونه حبابي را از ژل خارج كنيد .
مهاجرت پروتئيني يكپارچه نيست ( باندها خم مي شوند )	سايز حفرات ژل يكسان نيست . بخشي از ژل درگير نشده است . نشت الكتريكي (برق دزدي). خنك كردن ژل يكپارچه نيست ( در نتيجه يك بخش سريعتر از بخش ديگر حركت مي كند ) .	مطمئن شويد كه محلولهاي ژلي بخوبي مخلوط شده اند و پليمريزاسيون خيلي به سرعت انجام گرفته ( براي كاهش زمان پليمريزاسيون پرسولفات را كاهش دهيد . قبل از الكتروفورز هر حبابي را كه به ژل چسبيده حذف كنيد . مطمئن شويد كه اسپيسهاي كناري درجاي مناسب قرارگرفته اند . سيستم خنك كننده ژل را بهبود بخشيد يا ميزان گرما را با كاهش ولتاژ يا قدرت يوني بافر كاهش دهيد .

  

SDS-PAGE پروتئين ها

سديم دودسيل سولفات"SDS" يک دترجنت آنيوني است که به اغلب مولکولهاي پروتئيني در محلول هاي مايي و درpH  هاي متفاوت متصل مي شود. "SDS" تقريبا" به همه ي پروتئينها با نسبت تقريبي 4/1 گرم در 1 گرم پروتين اتصال مي يابد. براي همين "SDS"  باعث القاء بار الکتريکي منفي متناسب با اندازه در پلي پپتيدها ميگردد. علاوه بر اين "SDS" با تخريب پيوندهاي هيدروژني و بر هم کنش هاي هيدروفوبي, باعث تخريب ساختمان دوم و سوم پروتئين ها مي گردد. در صورت حضور يک ماده ي احيا کننده نظير "DTT"  پيوندهاي دي سولفيدي از گسسته وتاخوردگي پروتئين ها به طور کامل از بين مي رود. پلي پپتيدهايي که شکل طبيعي اشان توسط "SDS"  بر هم خورده و احيا هم شده اند به شکل ميله هايي انعطاف پذير در مي آيند که داراي بار منفي يک دست در واحد طول خود هستند. از آنجا که نسبت بار الکتريکي به جرم مولکولي در اين پلي پپتيدها تقريبا" نسبتي مشابه است, جداسازي پروتئين ها در الکتروفورز تحت چنين شرايطي تقريبا" به طور کامل وابسته به تفاوت در وزن مولکولي آنها است.

برخي پروتئين ها در "SDS-PAGE" رفتاري غيرعادي دارند به خصوص برخي گليكوپروتئين ها به مقادير عادي از "SDS" متصل نمي شوند, در نتيجه نسبت بار الکتريکي به وزن مولکولي در آنها مشابه اين نسبت در پروتئين هاي ديگر نيست و مهاجرت آنها کمتر بوده در نتيجه وزن مولکولي بيشتري از خود نشان خواهند داد.

پروتئين هايي با بارمنفي زياد و يا با  بار مثبت زياد, مثلا" هيستون ها, يا پروتئين هاي غني از پرولين, مثلا" كلاژن, در مجاورت "SDS" بطور غيرطبيعي وزن مولکولي بالايي از خود نشان مي دهند.

ّبه هرحال، "SDS-PAGE" در جداسازي پروتئين هايي با جرم مولكولي خيلي مشابه كه داراي تغييرات بعد از ترجمه, نظير استيليشن يا متيليشن يا فسفروريليشن, هستند از ارزش کمي برخوردار است. براي آناليز چنين پروتئين هاي تغيير يافته اي ، از روش PAGE با اوريک اسيد استفاده مي شود كه در آن هم وزن مولكولي و هم بار پروتئين در فرآيند جداسازي دخيل است . پروتئين در pH اسيدي بار مثبت دارد و در ميدان الكتريكي به سمت كاتد حركت مي كند . به اين دليل از روش PAGE اسيداوره عموماً براي جداسازي پروتئين هايي با سايز يكسان و بار متفاوت استفاده مي شود.

 

جاندارن تراژني درسلامتي انسان وحيوان و مديريت محصولات زراعي

                                                   احمد عابدي

گياهان وحيوانات وميكروبهاي تراژني محيط طبيعي را به سمت بهبود هدايت كرده است. در قرن21گياهان تراژني در زمين پيشرو خواهند بود  اين تحقيق براي جهاني شدن گياهان تراژني مقاوم در برابر فشار (خشكي ونمك) است در ازمايشگاه براي تثبيت نيتروژن به غلات ژن سبزي ملحق كردهاند

تا قبل از اين در تجارت قابل اطمينان ترين پيشرفت در حوزه گياهان گياهان مقاوم در برابر افت وعلف كش بوده است . 

گياهان تراژني براي بهبود فراورده هاي غذايي وسلامتي انسان وحيوان (گندم غني از ليسين،خرماي غني از روغن،سويا با اسيد جرب اشباع نشده وانگور داراي هورمون رشد)ونيز براي توليدات ويژهاز قبيل بيوپلي مر (افزايش مقاومت كتان )استفاده ميشود.

توليد واكسن هاي خوراكي در گياهان در برابر عوامل عفوني انسان وحيوان كه مي تواند سلامتي جمعيت هاي بزرگ را مخصوصا ًدر كشور هاي توسعه نيافته ودر جاهايي كه در حال حاضر تكنيك هاي واكسيناسين در دسترس نيست يا پرهزينه است بهبود بخشد.

حيوانات تراژني نقش بارزي را در سلامتي انسان ايفا خواهند كرد  پروتئينهاي درماني كه در حيوانات ترژني توليد شده اند پروتئين هاي دستوري اند براي توليدات ترشحي مثل خون وشير كاربرد دارند.

توليدات ميكروبهاي تراژني نقش مهمي در كشت وصنعت بيو تكنولوژي خواهند داشت

 ديگر تكنيك هاي زيستي ملكول براي مثال كشت بافت پينه ي استخواني مخروطيان به طور گسترده به جاي دانه در احياي جنگل مورد استفاده است .سيب زميني بدون ويروس و ديگر گياهان نتيجه كشت بافت است پادتن غير جنسي وديگر توليدات تكنولوژي ژن ممكن است باكارايي بيشتر در كشت بافت سلخته شده باشند

موفقيت تكنو لوژي ادامه پيدا مي كرد و ممكن بود انتظار رود كه در مبناي ان هميشه توسعه ائتلاف در زيستن بود اخيراً ميكروبها وحيوانات وگياهان كشف شده اند و بدين گونه نگهداري اين تنوع ژنتيك و ادامه تحقيق براي متغير هاي جديد ضروري است .

 ۳)مداخله ميكروبي براي تكميل مديريت گياهان زراعي :

ميكروبها در همه مراحل كشاورزي ضروري اند: در ساختمان وحاصلخيزي خاك و درگير كردن واثرات متقابل ميكروب وگياه در تهيه ونگهداري گياهان زراعي ودر بازيافت پس مانده هاي گياهان زراعي

بقاي جمعيت ماده‌يتلقيحي و بر انگيخته شدن اثر مثبيت ومنفي متقابل ان با جمعيت ميكروبهاي بومي سوالي رقابتي در تكنولوژي پديدار شدهاست. بيوتكنولوژي جديد نويد دهنده است اما اين سوالي بايد پاسخ داده شود

ناحيه اصلي در مداخله :

3.1)كود ريستي

يك احتياج وضرورت در كشاورزي ادامه تجديد پذيري تركيب و حاصلخيزي خاك با منابع تجديد شدني و كم كردن احيتاج به كودهاي شيميايي است

چشم اندازی در کشت و صنعت تکنولوژی زیستی

                                             علی اصغر نوروزی

بیشترین مقدار اهمیت و مصاعدت از تکنولوژی زیستی کشاورزی جهت پیشرفت که قادر است محيط آن را بر پا نگه دارد با استفاده از تكنولو‍ي ژ‍نتيك و هوش ميكروبهاي محصولات گياهي  و جانوري كه شيوهاي است شامل: مديريت اسرافي و تحليل كردن....كه اهمييت زيادي در فروش محصولات كشت و صنعت تكنولوژ‍ي زيستي دارد. هدف از بازنگری این است که تا ارائه بدهد یک نظر کلی از وضعیت حقوقی است. ممكن است زیست شناسی مولکولی و میکروبیولوژی کاربردی کشاورزی را متحول كند  که تکنولوژی زیستی کشاورزی جدید

ویژگی حاصلخیزی و کشاورزی منطقه را  افزایش خواهد داد

معرفی گیاهان و حیوانات و شیوه های کشاورزی جدید ممکن همگنی زیست بوم شناختی روی کره را تغییر دهد.

 مثل کاهش یافتن تنوع و گوناگونی كه باعث مي شود، گیاهان آسیب ببينند كه سبب عدم کنترل رشد سریع جمعیت و قحطی و خشکسالی شود. در قرن 21 جهت تخمير استون- بوتانول ميكروبهاي تكنولو‍ي زيستي توسعه يافت.

شیر یک منبع با ارزش سرشاراز  پروتئین كه میکروبها ،  واکسن های خوراکی در گیاهان خواهند بود . جمع آوری کشت و برزش میکروبی ، برای دانه گیاه و جمع آوری جرم پلاسم و محافظت کردن حیوانات خواهد داشت یک نقش مهم برای حفاظت کردن گوناگونی زیستی .

تکنولوژی ژنی برای بر یادداشتن کشاورزی شیوه ای برای توسعه دادن کشاورزی که همیشه دارد عصاره ای روی پنج عامل حیاتی و فردی محیط مناسب. تکنولوژی کشاورزی یکی از با پویایی ترین شاخه علمی در حال توسعه از تکنولوژی زیستی جدید در حال افزایش استفاده از ماورای هوش و نبوغ گیاهان و حیوانات در برداشت محصولات نوید بخش و امیدوار کننده کشاورزی مدرن و جدید کنونی ، خوراک و غذای جدید ، و تولید محصول صنعتی بهتر و تولید سلامتی محصول در قرن بیست و یک  است. مداخله و دخالت میکروبها سبب کار ساز و اثر داشتن در تقویت و نیرو بخشیدن هوش و نبوغ گیاهان و حیوانات در کشاورزی مدرن ضمیمه خواهند شد.

از طرف ديگر ، ممکن است اثرات منفی از تکنولوژی جدید ، تجدید سازمان و دگرگون کردن از کشاورزی و در حال نتیجه و ثمره و برخورد اجتماعی و اهمیت و پیامد منفی از دخالت کردن با هماهنگی و همگنی زیست بوم شناختی از استعداد طبیعت ، باید با دقت و احتیاط ، سنجیده و مطالعه و بررسی شود .

 

کروماتوگرافي مايع با کارائي بالا (HPLC)

                                       اميد مرادي , مهدي ديني

کروماتوگرافي مايع يکي از انواع کروماتوگرافي است که فاز متحرک در آن مايع است. کروماتوگرافي گازي نيز روش ديگري است که در آن فاز متحرک گاز است. اگر فاز متحرک گاز و فاز ساکن مايع باشد، روش را کروماتوگرافي گاز- مايع مي‌نامند. روش‌هاي کروماتوگرافي گاز- جامد، مايع- مايع و مايع- جامد نيز وجود دارند.در HPLC اغلب از ستون‌هاي پر شده با ذرات ريز فاز ساکن استفاده مي‌شود. به همين علت سطح بيشتري از فاز ساکن در ستون در معرض اجزاء نمونه قرار مي‌گيرد و در نتيجه راندمان جداسازي در اين روش بيشتر از ساير روش‌هاي کروماتوگرافي است. 

متن مقاله

کروماتوگرافي مايع با کارائي بالا (HPLC)
تسوت، گياه شناس روسي به عنوان کاشف پديده کروماتوگرافي شناخته شده است. او در اواخر قرن نوزدهم براي جداسازي رنگدانه‌هاي برگ سبز از يک ستون پرشده با کلسيم کربنات استفاده نمود. پس از او، دانشمندان زيادي در توسعه تئوري و روش کروماتوگرافي نقش داشته‌اند. از جمله مارتين و سينج که به علت توصيف کروماتوگرافي تقسيمي موفق به اخذ جايزه نوبل در سال 1952 شدند. در همان سال مارتين به همراه جيمز روش کروماتوگرافي گاز- مايع را معرفي نمود. تلاش‌ها و کوشش‌هاي اين دانشمندان باعث گرديد تا امروزه اين روش به عنوان يکي از مهمترين روش‌هاي کروماتوگرافي در تمامي شاخه‌هاي شيمي و علوم زيستي مطرح شود.
واژه کروماتوگرافي امروزه به دسته‌اي از روش‌ها اطلاق مي‌شود که در آنها جداسازي اجزاء موجود در يک نمونه مخلوط، بر اساس تمايل نسبي هر جزء به فاز ساکن هنگام عبور فاز متحرک از روي و يا درون فاز ساکن است. گونه‌اي که تمايل بيشتري به فاز متحرک دارد با سرعت بيشتري حرکت ‌مي‌کند و بالعکس گونه‌اي که به فاز ساکن تمايل بيشتري دارد، با سرعت کمتري در طول ستون حرکت مي‌کند.
به علت آن که مواد با درجات گوناگون به فازهاي ساکن تمايل دارند، مي‌توان از اين خاصيت جهت جداسازي آنها از يکديگر استفاده نمود. زمان مورد نياز براي حرکت هر جزء در فاصله مشخص را مي‌توان براي تجزيه‌هاي کيفي به کار برد. همچنين مقدار اندازه‌گيري شده براي هر جزء جدا شده نيز جهت تجزيه کمي سودمند است.
کروماتوگرافي با توجه به طبيعت فازهاي ساکن و متحرک به دسته‌هاي مختلفي تقسيم مي‌شود. برخي از روش‌هاي متداول کروماتوگرافي در جدول 1 ذکر شده است.

جدول 1- روش‌هاي متداول کروماتوگرافي [1].

نوع	فاز متحرک	فاز ساکن
گاز- مايع	گاز	مايع جذب شده روي جامد
گاز- جامد	گاز	جامد
زوج يون	مايع	مايع
تبادل يون	مايع	رزين تبادل يون
مايع- مايع	مايع	مايع جذب شده روي جامد
مايع – جامد	مايع	جامد
لايه نازک	مايع	جامد
کاغذ	مايع	مايع روي کاغذ جامد
دفع بر اساس اندازه	مايع	ژل
کروماتوگرافي فوق بحران	مايع فوق بحراني	گونه‌هاي آلي متصل به سطح جامد

 

کروماتوگرافي مايع يکي از انواع کروماتوگرافي است که فاز متحرک در آن مايع است. کروماتوگرافي گازي نيز روش ديگري است که در آن فاز متحرک گاز است. اگر فاز متحرک گاز و فاز ساکن مايع باشد، روش را کروماتوگرافي گاز- مايع مي‌نامند. روش‌هاي کروماتوگرافي گاز- جامد، مايع- مايع و مايع- جامد نيز وجود دارند.
کروماتوگرام ، نموداري از پاسخ آشکارساز بر حسب زمان، حجم فاز متحرک يا فاصله است. اطلاعات مفيدي نظير ميزان پيچيدگي نمونه، تعداد اجزاء موجود در نمونه، مشخصات کيفي اجزاي نمونه، درک کمي از درصد گونه‌ها موجود در نمونه و مشخصه‌هاي کارايي ستون، به سادگي از کروماتوگرام قابل حصول هستند.
در HPLC اغلب از ستون‌هاي پر شده با ذرات ريز فاز ساکن استفاده مي‌شود. به همين علت سطح بيشتري از فاز ساکن در ستون در معرض اجزاء نمونه قرار مي‌گيرد و در نتيجه راندمان جداسازي در اين روش بيشتر از ساير روش‌هاي کروماتوگرافي است.
در سيستم HPLC با استفاده از يک سوزن مخصوص وارد پيش ستون مربوطه مي‌شود. هم‌ زمان از يک حلال مخصوص جهت ترکيب شدن با نمونه استفاده مي‌شود. سپس نمونه با حلال مورد نظر ترکيب شده و وارد ستون مربوطه می شود و بر اساس ميزان قطبيت حلال و ترکيب از يکديگر جدا مي‌شوند. همچنین نمونه بر اساس زمان بازداري از يکديگر تفکيک مي‌شوند. شکل زير اجزاي يک سيستم HPLC را نشان مي‌دهد [1].

شکل 1- اجزا سيستم HPLC

 کاربردها:
1- جداسازی، خالص سازی و شناسائی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات داروئی. همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت داروها مورد استفاده قرار می گیرد [2].
2-در تحقیقات پروتومیک (تحقیقاتی که برروی پروتئین ها انجام می شود)، آنالیز و هضم پروتئین [2]
3-تعیین ساختار پلیمرها [3]
4-مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف [4]
مراجع

[1].D. A. Skoog, D. M. West Holt, "Principle of Instrumental Analysis", Saunders College Publishing, Sixth edition, 1994.
[2]. Goran Mitulović • Marek Smoluch • Jean-Pierre Chervet • Ines Steinmacher • Andreas Kungl, "An improved method for tracking and reducing the void volume in nano HPLC–MS with micro trapping columns", Analytical and Bioanalytical Chemistry , 2047,2, 2003.
[3]. Kevin Killeen, Hongfeng Yin, Dan Sobek, Reid Brennen and T. van de Goor, CHIP-LC/MS: HPLC-MS USING POLYMER MICROFLUIDICS, 7th international Conference on Miniaturized Chemical and Blochemlcal Analysts Systems, Squaw Valley, California USA, October 5-9, 2003.
[4]. Martin Vollmer. Edgar Nagele, Patric Horth, "Different Proteome Analysis: Two-Dimensional Nano-LC/MS of E. Coil Proteome Grown on Different Carbon Sources", J. Bimolecular Techniques, 14, 128-135, 2003

سيستم‌هاي كروماتوگرافي مايع

جهت انجام عمليات كروماتوگرافي مايع بطور كلي از دو روش پيوسته (Continues) و بچ (batch) مي‌‌توان استفاده كرد. روش كروماتوگرافي بچ روشي است كه مراحل مختلف كروماتوگرافي بصورت دستي با استفاده از هم‌زن (مرحلة اعمال نمونه يا جذب) و از طريق نيروي گرانشي بدون اِعمال فشار پمپ (مرحلة تعادل سازي، شستشو و مرحلة دفع يا خروج نمونه) انجام مي‌گيرد. اين روش مخصوصا" در مراحل اول فرايند تخليص در مورد ستونهاي كروماتوگرافي با قدرت جذب بالا و هنگامي كه ميزان حجم نمونه بسيار بالا باشد, جهت كاهش زمان انجام پروسه و احتراز از كاهش فعاليت پروتئين موردنظر در زمانهاي طولاني مورد استفاده قرار مي‌گيرد. بديهي است پارامتر اصلي در اين روش افزايش ميزان جذب نمونه به رزين‌هاي كروماتوگرافي و انجام تخليص بر روي حداكثر مقدار نمونة ممكن مي‌باشد.

در روش كروماتوگرافي پيوسته تمامي مراحل مختلف كروماتوگرافي با استفاده از يك سيستم اعمال فشار هيدروليك از طريق پمپ انجام مي‌گيرد. جهت انجام يك چنين فرايندي مي‌‌توان از سيستم‌هاي مختلفي نظير
Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC) ، High Performance Liquid Chromatography  (HPLC) و يا يك سيستم معمولي متشكل از پمپ، آشكار ساز و ثبات, نظير آنچه بصورت شماتيك در درس 1 آورده شده است, بعلاوة يك سيستم ايجاد گراديان استفاده كرد. بهرحال اساس كار سيستم‌هاي فوق يكي بوده و در واقع جهت ايجاد يك سيستم كروماتوگرافي مايع بر روي ستونهاي كروماتوگرافي مختلف (جهت انجام روشهاي متفاوت) بكار مي‌روند. تفاوت كار در اين سيستم‌ها تفاوت در ميزان فشار اعمال شده در مراحل مختلف، تفاوت در مرحلة انجام كروماتوگرافي از سلسله مراحل فرايند تخليص از نظر استراتژي تخليص و تفاوت در مقياس كار (از نظر آناليتيكال، كار صنعتي و يا نيمه صنعتي) است.اين تفاوتها طبيعتا" تغييرات زيادي را از نظر جنس و نوع ستونهاي كروماتوگرافي مورد استفاده, ميزان فشار مقاوم ايجاد شده در سيستم، ميزان تفكيك (Resolution) فرايند تخليص و مهمتر از همه امكانات برنامه‌ريزي و كنترل فرايند توسط سيستم ايجاد خواهند كرد.

سيستم HPLC در واقع ايجاد كنندة يك سيستم كروماتوگرافي مايع با فشار بسيار بالا (در حدود 20-10Mpa) است. از اين سيستم در مواردي كه نياز به قدرت تفكيك بالا در مراحل نهايي تخليص باشد, و يا در صورت نياز به روشهاي كروماتوگرافي خاص مانند روش كروماتوگرافي فاز معكوس (Reverse Phase Chromatography) (RPC) استفاده مي‌گردد. به همين دليل جنس ستونهاي كروماتوگرافي، اندازة رزينهاي كروماتوگرافي استفاده شده و روش پركني اين ستونها با سيستم‌هاي ديگر ايجاد كنندة كروماتوگرافي مايع متفاوت است. در اينجا ذكر اين نكته لازم است كه روش RPC از نظر مكانيزم شبيه روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك است و در اين روش كروماتوگرافي جذبي عمل تخليص با استفاده از جاذبة هيدروفوبيك بين يك ليگاند آلي و اجزاء مورد نظر انجام مي پذيرد. از آنجا كه اين روش در مقياس توليدي قرار نگرفته و جنبة تجزيه تحليل فرايند از نظر ساختار و درجة خلوص محصول را دارد، از بررسي آن اجتناب شده است. بديهي است جهت مطالعة بيشتر  اين روش مي‌توان به منابع كارگاه مراجعه كرد.

سيستم FPLC در يك دامنة فشار پايين‌تر از سيستمHPLC  (3-5 Mpa)  فرايند كروماتوگرافي مايع را با استفاده از روشهاي مختلفي كه قبلا" ذكر شد در يك مقياس توليدي مي‌تواند انجام دهد. بديهي است كه دبي جريان اعمال شده در اين سيستم نيز در محدودة بالا‌تري نسبت به سيستم HPLC قرار دارد. معمولا" چنين سيستمي از دو قسمت عمدة جداكننده (Separator) و كنترل كننده (Controller) تشكيل شده است. قسمت جدا کننده شامل دو پمپ ( براي وارد کردن بافر يا محلول هاي مختلف در مراحل مختلف فرايند), شيرهاي کنترل ( براي کنترل ورودي و خروجي جريان از پمپ ها به داخل ستون کروماتوگرافي), محل اتصال ستون کروماتوگرافي, قسمت اِعمال نمونه( از طريق پمپ سوم يا يک قسمت به نام super loop يا سرنگ), سنسورهاي اندازه گيري جذب  در  طول  موج  260 يا 280 نانومتر و  قدرت يوني  است. قسمت کنترل کننده شامل يک قسمت کنترل مراحل مختلف ورود و خروج جريان به داخل ستون, اِعمال برنامه هاي خاص براي خروج پروتئين , تعيين ميزان حساسيت جذب و قدرت يوني است. همچنين ثبت داده ها  مي تواند توسط يک دستگاه ثبات و يا کامپيوتر متصل به قسمت هاي اندازه گيري اين پارامترها انجام پذيرد. شرکت هاي مختلف سازنده سيستم هاي کروماتوگرافي امکانات و تجهيزات متقاوتي را در سيستم هاي مختلف عرضه مي نمايند که برخي از آنها در قسمت تجهيزات معرفي شده اند.

کروماتوگرافي گازي (GC)

                                                       اميد مرادي

 كروماتوگرافي گازي يک روش فيزيکي است که براي جداسازي، شناسايي و اندازه‌گيري اجزاي فرار به کار مي‌رود. به عنوان مثال جدا کردن بنزن (نقطه جوش 1/80) از سيلکوهگزان (نقطه جوش 8/80) بوسيله تقطير جزء به جزء غير ممکن است. در صورتي که آنها را در چند دقيقه مي‌توان به کمک کروماتوگرافي گازي جدا نمود و شناسايي کرد. همچنين حدود 200 جزء مختلف نفت خام را به آساني مي‌توان تشخيص داد. اين روش سريع و ساده است و براي تشخيص ناخالصي‌هاي موجود در يک ماده فرار يا مقادير کم مواد ضد آفت در پوست ميوه‌جات و اندازه‌گيري گازها و آلودگي مواد به کار مي رود. 

متن مقاله

کروماتوگرافي گازي در سال 1952 به وسيله جيمز و مارتين براي جدا کردن مقادير کم اسيدهاي چرب به کار برده شد. GC يک روش فيزيکي است که براي جداسازي، شناسايي و اندازه‌گيري اجزاي فرار به کار مي‌رود. به عنوان مثال جدا کردن بنزن (نقطه جوش °1/80) از سيلکوهگزان (نقطه جوش °8/80) بوسيله تقطير جزء به جزء غير ممکن است. در صورتي که آنها را در چند دقيقه مي‌توان به کمک کروماتوگرافي گازي جدا نمود و شناسايي کرد. همچنين حدود 200 جزء مختلف نفت خام را به آساني مي‌توان تشخيص داد. اين روش سريع و ساده است و براي تشخيص ناخالصي‌هاي موجود در يک ماده فرار يا مقادير کم مواد ضد آفت در پوست ميوه‌جات و اندازه‌گیري گازها و آلودگي مواد به کار می رود [1].
در کروماتوگرافي گازي، فاز متحرک يک گاز است. فاز ساکن يک مادة جاذب جامد يا مايع پوشش داده شده و يا داراي پيوند با يک جامد بر روي ديواره ستون است. اگر فاز ساکن جامد باشد، روش را کروماتوگرافي گاز- جامد (GSC) و اگر فاز ساکن مايع باشد، روش را کروماتوگرافي گاز- مايع (GLC) مي‌نامند. هر چند هر دو روش در تجزيه به کار مي‌روند ولي GLC بيشتر مورد استفاده قرار مي‌گيرد.
جدا شدن اجزاي يک نمونه فرار در GLC بر اساس تقسيم آنها بين دو فاز مايع و گاز است. نمونه در فاز متحرک حل شده و فاز ساکن يک مايع ديرجوش است که به صورت لاية نازکي بر روي ذرات يک جامد گسترده شده است. کروماتوگراف گازي از قسمت‌هاي زير تشکيل شده است [1].

شکل 1:نماي ساده يک کروماتوگراف گازي [1]

گاز حامل بايد يک گاز بي‌اثر باشد تا با فاز ساکن، حلال و يا نمونه واکنش ندهد، به همين دليل معمولاَ از نيتروژن يا هليم استفاده مي‌شود. در دماي ثابت، فشار و سرعت جريان گاز به طرف ستون را با تنظيم کنندة فشار و جريان سنج، ثابت نگه مي‌دارند. مقدار µL 1/0-5 از نمونه مايع به وسيله يک سرنگ مخصوص وارد قسمت تزريق نمونه مي‌شود. نمونه‌هاي جامد را بايد در يک حلال فرار مناسب،‌ حل و سپس تزريق نمود. براي نمونه‌هاي گازي بايد حجم‌هاي بيشتري انتخاب شود. نمونه پس از تزريق در نتيجة گرماي حاصل از سيستم الکتريکي تبديل به گاز مي‌شود و با گاز حامل مخلوط شده، به طرف ستون مي‌رود.
فاز ساکن يک مايع ديرجوش مانند روغن پارافين يا روغن سيليکون است که تا حدود 400 مقاوم است و به صورت لايه نازکي روي ذرات جامد گسترده شده است. مايع به کار رفته بايد از نظر شيميايي غير فعال بوده و براي اجزاي نمونه قابليت انحلال مختلفي داشته باشد. علاوه بر ستون‌هاي پر شده مي‌توان از ستون‌هاي مويين به طول حدود cm 10-100 و قطر داخليcm 0/25-0/32 استفاده نمود که داخل آنها از سليت پوشيده شده است و فيلم نازکي از مايع ديرجوش بر روي پوشش سيليسي قرار دارد.
جدا شدن مواد در ستون، نظير فرايند استخراج است. نمونه که در فاز گاز محلول است از بالاي ستون وارد مي‌گردد و اجزاي آن بر حسب ضريب توزيع خود بين دو فاز مايع و گاز تقسيم مي‌شوند. در نتيجه اجزاي موجود در نمونه بر حسب تمايلي که ستون براي نگهداري آنها دارد از يکديگر جدا شده و به وسيله عبور گاز حامل،‌ اجزا جدا مي‌شوند و به ترتيبي که متناسب با عکس تمايل نگهداري ستون براي آنها است، از انتهاي ستون خارج شده، وارد آشکارساز مي‌گردند. در آشکارساز اجزاء جدا شده موجود در گاز حامل مورد شناسايي و اندازه‌گيري قرار مي‌گيرند.
دماي ستون GC را مي‌توان روي دماي خاصي تنظيم کرده و به صورت همدما جداسازي را انجام داد. همچنين در برخي موارد که اجزاي نمونه در ستون به خوبي جدا نمي‌شوند، براي جداسازي بهتر از روش برنامه‌ريزي دمايي استفاده مي‌شود. در اين روش دماي ستون را طبق برنامه‌اي از پيش تعيين شده و با سرعتي مناسب افزايش مي‌دهند تا مواد به تدريج از يکديگر جدا شوند [1].
کاربردها
برخی از کاربردهای مهم کروماتوگرافی گازی(GC) در فناوری نانو عبارتست از:

1- جداسازی و شناسائی برخی از ترکیبات آلی [2]
2-تعیین ساختار ترکیبات آلی در لاستیک [2]
3-آنالیز برخی داروهای نانو ذرات [3]

مراجع:

1- D. A. Skoog, D. M. West Holt, Principle of Instrumental Analysis, Saunders College Publishing, Sixth edition, 1994.
2- E. Vidal, Augusta, E-MRS Spring Meeting 2003 June 10 - 13, 2003.
3- M. Praisler, S. Gosav, J. Van Bocxlaer, A. De Leenheer, and D.L. Massart. Exploratory analysis for the identification of amphetamines using neural networks and GC-FTIR data, The Annals of the University "Dunãrea de Jos", Fascicle II, p. 83-96, ISSN 1221-4531, 2002.

مراكز بين‌المللي‌ فعال‌ در زمينه‌ بيوتكنولوژي‌ در ایران

يونسكو  UNESCO

 

             پيشرفت‌ در زمينه‌ بيوتكنولوژي‌ به‌ وجود ميكروارگانسيم‌هاي‌ مفيد بستگي‌ دارد. بطوريكه‌ توسعه‌ فرايندهاي‌ بيوتكنولوژي‌ مدرن‌ وابسته‌ به‌ بهره‌برداري‌ بهينه‌ از مخازن‌ متنوع‌ ميكروبي‌ است‌. فرايندهاي‌ بيوتكنولوژي‌ شامل‌ استفاده‌ از ميكروارگانيسم‌ زنده‌ يا فرآورده‌هاي‌ آن‌ نظير آنتي‌بيوتيك‌ها و آنزيم‌ها بدون‌ آسيب‌ به‌
 محيط‌ زيست‌ است‌ ضمن‌ اينكه‌ امروزه‌ از ميكروارگانيسم‌ها در تهيه‌ سوختهاي‌ فسيلي‌، انرژي‌ زيستي‌، داروهاي‌ نوتركيب‌ و پاكسازي‌ محيط‌ زيست‌ استفاده‌ مي‌گردد.

             كشف‌ سويه‌هاي‌ ميكروبي‌ جديد و همچنين‌ توليد ميكروارگانيسم‌هاي‌ دستكاري‌ شده‌ ژنتيكي‌ در توليد محصولات‌ تخميري‌ و فرآورده‌هاي‌ بيولوژيك‌ نقش‌ اساسي‌ داشته‌ و در عين‌ حال‌ به‌ بازگشت‌ سرمايه‌ نيز سرعت‌ بيشتري‌ خواهد بخشيد. از اينرو مي‌توان‌ با سرمايه‌گذاري‌ كوتاه‌ مدت‌ در انتظار به‌ نتيجه‌ رسيدن‌ تحقيقات‌ بيوتكنولوژي‌ بود. هم‌اكنون‌ سازمان‌ يونسكو پنجاه‌ و پنجمين‌ سالگرد تأسيس‌ خود را جشن‌ مي‌گيرد و همين‌جا بايد نقش‌ اين‌ سازمان‌ در نگهداري‌ و توسعه‌ ذخاير ميكروبي‌ جهان‌ يادآوري‌ گردد. يونسكو به‌ منظور تأمين‌ ميكروارگانيسم‌هاي‌ صنعتي‌ در دهه‌ 1970 با همكاري‌ برنامه‌ محيط‌ زيست‌ سازمان‌ ملل‌ (UNEP)
  تأسيس‌ يك‌ شبكه‌ از مراكز منابع‌ ميكروبي
‌ (MIRCENs) 
 را آغاز كرد كه‌ هدف‌ آن‌ تأمين‌ نيازهاي‌ كشورهاي‌ درحال‌ توسعه‌ بود. در طول‌ سالهاي‌ 1975 تا 1984 با همكاري‌ برنامه‌ محيط‌ زيست‌ سازمان‌ ملل‌ بانك‌هاي‌ ميكروبي‌ بانكوك‌ (تايلند)، داكار (سنگال‌)، نايروبي‌ (كنيا)، پورت‌ الگرو (برزيل‌)، قاهره‌ (مصر)، گواتمالاسيتي‌ (گواتمالا) ايجاد شد. با اينكه‌ شبكه‌ بين‌ المللي‌ مراكز منابع‌ ميكروبي‌ يونسكو عمدتاً براي‌ كشورهاي‌ درحال‌ توسعه‌ تأسيس‌ شده‌ است‌، در دهة‌ 1980 اين‌ شبكه‌ها در كشورهاي‌ داراي‌ تكنولوژي‌ پيشرفته‌ نيز تأسيس‌ گرديد بطوريكه‌ در سالهاي‌ 1987 تا 1993 با همكاري‌ 
 UNDP 
 اين‌ مراكز در بوداپست‌ (روماني‌) و لوبيجيانا (اسلوني‌) نيز به‌ بهره‌برداري‌ رسيد. در سال‌ 1992 با همكاري‌ برنامه‌ توسعه‌ سازمان‌ ملل‌ مركز مشابهي‌ نيز در ايران‌ تأسيس‌ شد. از ديگر شبكه‌هاي‌ بين‌المللي‌ مراكز منابع‌ ميكروبي‌ مي‌توان‌ به‌ مراكزي‌ در آرژانتين‌، كانادا، چين‌، فرانسه‌، آلمان‌، هنك‌كنگ‌، آفريقاي‌ جنوبي‌، كنگو، انگليس‌ و آمريكا اشاره‌ كرد كه‌ در چارچوب‌ برنامه‌هاي‌ همكاري‌ با كميسيون‌هاي‌ ملي‌ يونسكو تأسيس‌ شده‌اند. هم‌اكنون‌ سي‌ويك‌ مركز منابع‌ ميكروبي‌ در 23 كشور جهان‌ درحال‌ فعاليت‌ مي‌باشند.

             اين‌ شبكه‌ها براي‌ مديريت‌، توزيع‌ و استفاده‌ از گنجينه‌ ژنهاي‌ ميكروبي‌ در سراسر جهان‌ تسهيلاتي‌ فراهم‌ آورده‌ و به‌ حفظ‌ و نگهداري‌ ميكروارگانيسم‌ها كمك‌ مي‌نمايند. علاوه‌ برآن‌ توسعه‌ تكنولوژي‌هاي‌ جديد و ارزان‌ را براي‌ مناطق‌ خاص‌ مورد تشويق‌ قرار مي‌دهند. اين‌ مراكز كاربردهاي‌ ميكروبيولوژي‌ را در تقويت‌ اقتصاد روستائي‌ ترويج‌ و بويژه‌ در كشورهاي‌ درحال‌ توسعه‌ مراكزي‌ بومي‌ براي‌ آموزش‌ ايجاد
 مي‌كنند.

             هر مركز زمينه‌ پژوهشي‌ خاص‌ دارد. چندين‌ مركز در كشورهاي‌ درحال‌ توسعه‌ از جمله‌ كنيا، مصر، چين‌، ايران‌، تايلند و سنگال‌ مشغول‌ تحقيق‌ در زمينه‌ كودهاي‌ بيولوژيك‌ هستند تا وابستگي‌ مناطق‌ خود به‌ كودهاي‌ گران‌ شيميايي‌ را كه‌ اثرات‌ منفي‌ نيز بر روي‌ محيط‌ زيست‌ دارند، كاهش‌ دهند. مركز منابع‌ ميكروبي‌ كنيا برنامه‌اي‌ را آغاز كرده‌ است‌ كه‌ طي‌ آن‌ 20000 پاكت‌ كود بيولوژيك‌ يا خاكستر سياه‌ را در اختيار كشاورزان‌ كنيا و كشورهاي‌ همجوار قرار مي‌دهد. مركز منابع‌ ميكروبي‌ چين‌ در زمينه‌ ميكروارگانيسم‌هاي‌ تثبيت‌ كننده‌ ازت‌ نظير ريزوبيوم‌ و فرانليا، حشره‌كش‌هاي‌ بيولوژيك‌ نظير باسيلوس‌ اسفريكوس‌، توليد آنزيم‌هاي‌ صنعتي‌ و ميكروارگانيسم‌هاي‌ تصفيه‌كننده‌ فاضلاب‌ فعاليت‌ دارد. مركز منابع‌ ميكروبي‌ سنگال‌ در غرب‌ آفريقا مسئول‌ فعاليتهاي‌ مربوط‌ به‌ توليد كودهاي‌ بيولوژيك‌ با استفاده‌ از ريزوبيوم‌ مي‌باشد. اين‌ مركز در سال‌ 1983 تأسيس‌ و در اولين‌ فعاليت‌ خود اقدام‌ به‌ ايجاد يك‌ كلكسيون‌ از سويه‌هاي‌ ريزوبيوم‌ و ميكوريزا براي‌ استفاده‌ در كشاورزي‌ پايدار نمود.

             مركز منابع‌ ميكروبي‌ ايران‌ در پژوهشكده‌ بيوتكنولوژي‌ سازمان‌ پژوهشهاي‌ علمي‌ و صنعتي‌ ايران‌ قرار داشته‌ و در سال‌ 1992 با همكاري‌ برنامه‌ توسعة‌ سازمان‌ ملل‌ 
(UNDP) 
 تأسيس‌ شد و مهمترين‌ فعاليتهاي‌ آن‌ مبارزه‌ بيولوژيك‌ عليه‌ مالاريا، توليد حشره‌كش‌ ميكروبي‌ با استفاده‌ از باسيلوس‌ تورانژيانسيس‌، توليد آنزيم‌هاي‌ صنعتي‌ و توليد كودهاي‌ بيولوژيك‌ مي‌باشد.

             آموزش‌ نيروهاي‌ علمي‌ در كشورهاي‌ ديگر از جمله‌ فعاليت‌هاي‌ يونسكو است‌. بسياري‌ از پژوهشگران‌، نيروهاي‌ ترويجي‌ و كاركنان‌ فني‌ از دوره‌هاي‌ كوتاه‌ و برنامه‌هاي‌ آموزشي‌ فشرده‌ ضمن‌ كار كه‌ در مراكز مختلف‌ برگزار مي‌شود، بهره‌برده‌اند. در سال‌ 1991 يونسكو طرح‌ اعطاي‌ بورسهاي‌ كوتاه‌مدت‌ بيوتكنولوژي‌ به‌ دانشمندان‌ كشورهاي‌ كمتر توسعه‌ يافته‌ و درحال‌ توسعه‌ را آغاز كرد تا آنها بتوانند ضمن‌ پژوهش‌ در يكي‌ از مراكز منابع‌ ميكروبي‌ استفاده‌ از تكنيكهايي‌ را كه‌ معمولاً در دسترسشان‌ نيست‌، بياموزند.

             از ديگر فعاليت‌هاي‌  
MIRCEN
  مي‌توان‌ همكاريهاي‌ بين‌المللي‌ و انتقال‌ دانش‌ فني‌ بين‌ اعضاء را نام‌ برد. درحال‌ حاضر شبكه‌ منابع‌ ميكروبي‌ آرژانتين‌ و گواتمالا با كمك‌ مراكز فعال‌ در كانادا، ژاپن‌ و انگلستان‌ درحال‌ انجام‌ آزمايشهايي‌ بر روي‌ فرمانتورهاي‌ موجود به‌ منظور بهينه‌سازي‌ فرايند توليد تخميري‌ اتانول‌ و همچنين‌ توليد آنزيم‌هاي‌ صنعتي‌ و هورمونهاي‌ استروئيدي‌ مي‌باشند. فعاليت‌ مشابهي‌ بين‌ مركز منابع‌ ميكروبي‌ بانكوك‌ و پكن‌ با اين‌ مراكز در استراليا و ژاپن‌ وجود دارد. شبكه‌ منابع‌ ميكروبي‌ استراليا، ژاپن‌ و انگلستان‌ با همكاري‌ هم‌ دوره‌هاي‌ آموزشي‌ بلندمدت‌ را براي‌ محققين‌ جوان‌ كشورهاي‌ درحال‌ توسعه‌ فراهم‌ نموده‌اند.

             شبكه‌ بين‌المللي‌ مراكز منابع‌ ميكروبي‌ يونسكو همكاري‌ بسيار زيادي‌ با كلكسيون‌ نگهداري‌ كشت‌ ميكروبي‌ آمريكا  
(ATCC)
 ، كلكسيون‌ نگهداري‌ و كشت‌ ميكروبي‌ بين‌المللي‌  
(NCTC)
  و كلكسيون‌ ميكروبي‌ مجارستان‌ و آلمان‌ به‌منظور نگهداري‌ و تبادل‌ سويه‌هاي‌ ميكروبي‌ و كشت‌هاي‌ سلولي‌ دارند.

             MIRCEN 
 به‌ منظور انتقال‌ تكنولوژي‌ نيز مراكز منطقه‌اي‌ ايجاد كرده‌ است‌. مهمترين‌ فعاليتهاي‌ اين‌ مراكز تحقيق‌ بر روي‌ ترتيب‌ نوكلئوتيدي‌  DNA تك‌زنجيره‌، اسيدهاي‌ نوكلئيك‌ نشاندار، هيبريدوما و مهندسي‌ ژنتيك‌ ميكروارگانيسم‌ها مي‌باشد.

             انجمن‌ بيوتكنولوژي‌ كاربردي‌  (BAC)  در سال‌ 1990 با همكاري‌ گروهي‌ از دانشمندان‌ و محققين‌ رشته‌هاي‌ مرتبط‌ بوسيله‌ يونسكو تشكيل‌ شد. اين‌ انجمن‌ سازماني‌ غيرانتفاعي‌ و غيردولتي‌ است‌ و از جمله‌ فعاليت‌هاي‌ آن‌ برگزاري‌ دوره‌هاي‌ كوتاه‌مدت‌ آموزشي‌ براي‌ محققيني‌ است‌ كه‌ در زمينه‌ بيوتكنولوژي‌ گياهي‌ يا بيوتكنولوژي‌ دريا فعاليت‌ مي‌نمايند و تسهيلات‌ بيشتري‌ را به‌ محققين‌ بالاتر از 40 سال‌ كشورهاي‌ درحال‌ توسعه‌ اختصاص‌ داده‌ است‌.

             مركز منابع‌ ميكروبي‌ ايران‌ مرجع‌ منطقه‌اي‌ آسياي‌ جنوب‌غربي‌ و ميانه‌ براي‌ بيوتكنولوژي‌ بوده‌ و در زمينه‌ آموزش‌، پژوهش‌ و تكنولوژي‌ سازگار با محيط‌زيست‌ فعاليت‌ مي‌نمايد.  MIRCEN  ايران‌ بعنوان‌ مرجع‌ منطقه‌اي‌ بيوتكنولوژي‌ مجري‌ طرح‌هاي‌ نيمه‌ صنعتي‌ بوده‌ و در زمينه‌ انتقال‌ تكنولوژي‌ در فرايند فرمانتاسيون‌ فعاليت‌ دارد. بانك‌ ميكروبي‌ ايران‌ با كشورهاي‌ مختلف‌ تبادل‌ ميكروارگانيسم‌ دارد. همچنين‌ ايران‌ عضو فدراسيون‌ جهاني‌ كلكسيون‌ ميكروارگانيسم‌ها  (WFCC)  بوده‌ و باعنوان‌  PTCC  و كد  L124  ثبت‌ شده‌ است‌.

             دو كارگاه‌ منطقه‌اي‌ بيوتكنولوژي‌ با همكاري‌ يونسكو در تهران‌ برگزار شده‌ است‌. در سال‌ 1370 اولين‌ كنگره‌ منطقه‌اي‌ بيوتكنولوژي‌ در ايران‌ برگزار گرديد. تاكنون‌ 9 نفر از محققين‌ كشور كه‌ در زمينه‌ بيوتكنولوژي‌ فعاليت‌ دارند، به‌ يونسكو معرفي‌ شده‌ تا در دوره‌هاي‌ كوتاه‌مدت‌ يونسكو شركت‌ نمايند. همچنين‌ 3 نفر از محققين‌ ساير كشورها براي‌ گذراندن‌ دورة‌ آموزشي‌ كوتاه‌مدت‌ به‌ ايران‌ آمده‌اند

 

Bacillus thuringiensis

agriculture-station.blogfa              

بر اساس گزارشات سازمان ملل ، حدود 800 ملیون نفر از جمعیت جهان (  14 در صد ) دچار نفر فقر غذایی هستند که تا سال 2020 به یک میلیارد نفر خواهد رسید. از سوی دیگر ، بشر با استفاده نسبتا کامل از منابع و امکانات موجود ، امروزه برای افزایش تولیدات کشاورزی با محدودیت منابع موجه است . در این راستا ، فناوری زیستی یا بیوتکنولوژی – کشاورزی افقی روشن در برابر دیدگان ما می گشاید . تا شاهد دومین انقلاب سبز باشیم .

پیچیده ترین شاخه بیوتکنولوژی ؛ مهندسی ژنتیک Genetic Inginearing  ، می باشد که روشهای مبتنی بر ژنتیک سلولی ملکولی ، نشانگرهای ملکولی ، کشت سلولی بافت ، میکروبیولوژی و بیوشیمی را در بر می گیرد . به طور کلی مهندسی ژنتیک شامل استفاده از روشهای انتخاب ژن مورد نظر ، جداسازی ، خالص سازی ، تکثیر و انتقال ژن ها و ارزیابی بروز آنها در موجود زنده می باشد .

یکی از مهمترین و کاربردی ترین استفاده های مهندسی ژنتیک در کشاورزی تراریزش یا انتقال ژن و تولید گیاهان و جانواران تراریخته transgenic Plant  می باشد . این گیاهان دارای صفات جدید و یا تغییر یافته ای هستند که می توانند قابلیت مقابله با آفات را به طور اتوماتیک داشته باشند و این مسئله درآنها به حالت بالقوه در آید.

از سال 1901 که " ایشی واتا " باکتری شناس ژاپنی ، از بدن یک لارو مرده کرم ابریشم باکتری را جدا کرد تاکنون قریب به یک قرن است که مطالعات گسترده ای در زمینه تاثیرات و نحوه عملکرد و اثر این باکتری انجام می گیرد .

Bacillus thuringiensis     یا BT  نامی آشنا در کنترل آفات و حشرات است که در تولید بیش از 90%   آفت کش های  میکروبی و تعداد زیادی از گیاهان  فراریخته مقاوم به حشرات کاربرد دارد ؛ به عنوان عاملی برای مبارزات بیولوژیک این باکتری یک باسیل گرم مثبت و اسپورزا است که به دلیل دارا بودن توکسین هایی که خواص حشره کشی دارند ، در مقابله با حشرات زیان آور کشاورزی ، بهداشت و محیط زیست جایگاه مهمی دارد .

توکسین های این باکتری که به " دلتا اندو توکسین " معروفند ، در حقیقت پروتئین های کریستالی هستند که هنگام اسپورزایی باکتری تولید می شوند . هنگامی که این توکسین توسط حشره بلعیده می شود .پروتئین کریستالی در محتویات و شیره قلیایی روده حشره حل شده و تحت تاثیر آنزیم های پروتئاز به قطعات کوچک تر تبدیل می شود . در اثر واکنش هایی که این قطعات با سلولهای اپی تلیال روده میانی حشره انجام می دهند ، دیواره روده حشره سوراخ شده و محتویات روده با هموسل مخلوط می گردد که این امر موجب بروز یک عدم تعادل بیوشیمیایی در بدن لارو می شود که برای حشره کشنده است . پس از جذب میزان کافی از توکسین و صورت پذیرفتن  فعل و انفعالات مذکور ، لارو دست از تغذیه می کشد، در نتیجه ظرف چند روز از گرسنگی می میرد .

پژوهشها نشان داده است که این باکتری قابلیت استفاده علیه طیف وسیعی از آفات راسته های Lepidoptera, Coleoptera,dipter,Homoptera و حتی آفات غیره حشره مانند نماتد ها و پارازیتهای حیوانات اهلی را دارا می باشند .

 

چند مثال از کاربرد های BT:

-         انتقال ژن BT به باکتری خاکزی Pseudomonas fluorescence

که با ریشه غلات و سویا همزیست می باشد و اضافه کردن این باکتری به خاک می تواند خسارت کرم اگروتیس یا شب پره زمستانی

(Agrotis ipsilon or Black cutworm ) در غلات را کنترل کند .

-         انتقال ژن BT به یک ریز سازواره درونزاد Endophyte Microorganism  که داخل دستگاه آوندی گیاهان زندگی می کند و تکثیر می شود و آغشته سازی بذور ذرت و برنج با آنها ، موجب کنترل کرم ساقه خوار ذرت و برنج می شود .

-         آزمایشات مزرعه ای نشان داده است که ریزسازواره در خارج از گیاه زنده نمی ماند و به گیاهان تلقیح نشده همجوار نیز منتقل نمی شود . بنابر این مشکل زیست محیطی نخواهد داشت .

در پایان باید یاد آور شد که استفاده از روشهای مبتنی بر مبارزات بیولوژیک با آفات به جای استفاده از سموم شیمیایی هم از نظر حفاظت محیط زیست بسیار حائز اهمیت است و هم از نظر صرفه جویی اقتصادی کشاورزان ، به عبارتی می تواند بهینه سازی مبارزه و کنترل آفات باشد .

جداسازي پلاسميد از چند گونه باكتري گياهي

                   علي قرباني‌كهريزسنگي: حشمت‌الله رحيميان، علي آهون‌منش

وجود پلاسميد در باكتريهاي P.syringae PV.syringae , psedomonas avenae Erwinia ananas , Agrobacterium tumefaciens , P.solanacearum salmonella SP,Esherichia coli Xanthomonas campestris PV. hedereبه كمك چند روش جداسازي پلاسميد مورد مطالعه قرار گرفت .استرين‌هاي باكتريائي برروي محيط كشت مناسب خود بمدت 24-48 ساعت رشد داده شدند. سلولهاي باكتري در بافر TE سوسپانسيون گرديده تا جذب نوري آنها در طول موج 600 نانومتر برابر با 5ˆ1 شد. سديم دو دسيل سولفات (SDS) به غلظت نهائي 1 درصد اضافه و لايزت 3بار ازسرنگ شماره 18 عبور داده شد. PH لايزت محتوي قطعات DNA كروموزومي با اضافه كردن سود 3 نرمال به 2ˆ12 و بدنبال آن با اضافه كردن تريس 2 مولار، 7 = PH به -9 5ˆ8 رسانده شد. سپس كلرورسديم 3 درصد و بدنبال آن يك حجم فني اشباع از كلرورسديم 3 درصداضافه گرديد و به آرامي به هم زده شده و سانتريفوژ گرديد. لايزت سانتريفوژ شده و فازروئي جداگرديد . كلرور منيزيم و بافر فسفات سديم 15ˆ0 مولار، 7 = PH و بدنبال آن 7ˆ0 حجم اتانول خنك (سرد) اضافه و لوله‌ها بمدت 12 ساعت در -20 درجه سانتيگراد نگهداري‌شدند. پس از سانتريفوژ در دور پائين و بدنبال آن حل رسوب حاصل در EDTA، بمدت 24 ساعت در بافر TES دياليز شدند. سوسپانسيونهاي مرحله نهائي، برروي صفحه افقي ژل 8ˆ0 درصد آگارز در ولتاژ 80 ولت بمدت 8 ساعت الكتروفورز شدند. سپس ژل در اتيديوم برومايد(4ˆ0 ميكروگرم در ميلي‌ليتر) قرار داده شد . باندهاي پلاسميدي در زير يك دستگاه UV-transilluminator آشكار گرديدند. از بين استرين‌هاي باكتريائي مورد مطالعه، Erwinia ananas داراي 2 پلاسميد به اندازه 83 و 2ˆ12 مگادالتون و Xanthomonas campestris Pv.hederaeداراي يك پلاسميد با وزن مولكولي 100 مگادالتون بودند . وزن مولكولي اين پلاسميدها با استفاده از پلاسميدهائي با وزن مولكولي مشخص از باكتريهاي Agrobaeterium radiobacter 84 (8ˆ29 و 124 مگادالتون) و Pseudomonas glumae Ku 8121 (8 و 85 و 124 مگادالتون) تعيين‌شد. در آزمايش مقاومت به آنتي‌بيوتيكها Xanthomonas campestris Pv.hederae و Erwinia ananas به پني‌سيلين و آمپي‌سيلين مقاوم بودند. هيچكدام از پلاسميدها با آكريدين اورنج و اتيديوم برومايد حذف نشدند.

انگشت نگاري DNA جدايه هاي Fusarium solani عامل پژمردگي و پوسيدگي خشك فوزاريومي سيب زميني در استانهاي

ساره بقايي راوري - ماهرخ فلاحتي رستگار - بهروز جعفرپور - فرهاد شكوهي فر - مجتبي مرادزاده

گونه هاي مختلف فوزاريوم از مهمترين عوامل كاهش سلامت و عملكرد گياهان زراعي بشمار مي روند. در اين بين گونه Fusarium solani عامل بيماري پژمردگي و پوسيدگي خشك فوزاريومي سيب زميني مي باشد. با توجه به جايگاه ويژه اين بيماريها در مزارع و بخصوص انبارهاي مناطق عمده سيب زميني كاري كشور، تنوع ژنتيكي جمعيت اين بيمارگر در استانهاي خراسان رضوي و شمالي بررسي شده است. بدين منظور بيست و دو جدايه استانهاي مذكور به همراه شش جدايه از استانهاي اردبيل و همدان و تهران انتخاب و با استفاده از نشانگرهاي ISS،ISSR،RAPD تنوع و شباهت ژنتيكي آنها بررسی شد

استخراج DNAي ژنومي

براي استخراج DNA از بافتهاي برگي استفاده گرديد. بذور هر يك از توده‌ها در گلدان كاشته شده و 20 روز پس از كاشت، 5 بوته از هر توده انتخاب گرديده و برگهاي هر بوته بطور جداگانه چيده شده و در داخل ورقه. آلومينيومي پيچيده و بر روي يخ گذاشته و بلافاصله به آزمايشگاه منتقل مي‌شد. مقدار 20 ميلي‌گرم از برگ بوته‌هاي انتخابي مربوط به هر توده را وزن نموده و سپس برگهاي 5 بوته با هم مخلوط مي‌شد و براي استخراج DNA مورد استفاده قرار مي‌گرفت (60، 107). استخراج DNA با استفاده از CTAB [1] و بر اساس روشي كه توسط سقائي معروف و همكاران در سال 1984 ارائه شده صورت گرفت (121). البته محلول‌هاي مورد نياز اين روش استخراج به شرح زير آماده شد:

الف – بافر استخراج [2] : براي تهية cc100 محلول بافر مواد زير مورد نياز است.

%2 M4/1 0/8 = pH و M1/0 mM20 0/8 = pH و %2/0

CTAB -1 NaCl -2 Tris-HCl – 3 [3] EDTA – 4 β-mercaptoetchanol - 5

 

مواد بالا را در داخل آب دوبار تقطير حل نموده و حجم نهايي را به cc100 مي‌رسانيم. قبل از استفاده، محلول توسط اتوكلاو استريل مي‌گرديد.

---

[1] - Cethyle Trimethyle Amonium Bromide

[2] - Extraction buffer

[3] - Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

اصول طراحي آغازگر

1)     در آغازگر اختصاصي، طول آغازگر 18 تا 30 نوکلئوتيد باشد.

2)     حاوي تقريبا" تعداد يکساني از هر نوکلئوتيد باشد.

3)  از تکرار نوکلئوتيد مشابه پشت سر هم و به حالت وصله اي اجتناب شود تا باعث چسبيدن اشتباهي آغازگر روي قالب DNA نشود.

4)  از قرار گيري سه يا تعداد بيشتري G يا C در انتهاي ´3 اجتناب شود، چون اين باعث شروع تکثير اشتباهي  در ناحيه غني از GC مي شود.

5)  ساختار ثانويه در داخل رشته مکمل تشکيل ندهند. از جفت هايي که داراي توالي مکمل در انتهاي ´3 باشند، اجتناب شود. از تشکيل حلقه هاي سر سنجاقي جلوگيري شود.

6)  انتهاي ´3 داراي توالي هايي نباشد که باعث جفت شدن بازها در آغازگرها، آغازگر ها با خودشان يا با هر آغازگر ديگري، بشود و تشکيل فرم Primer-dimer را بدهند.

7)  يک جفت آغازگر که به صورت موفق و عالي کار خود را انجام بدهد، وجود ندارد و بنابراين بعضي از جفت آغازگر ها 100 تا 1000 برابر حساس تر از ديگر آغازگر ها هستند و باعث عدم نتيجه گرفتن و اشتباه شدن نتايج مي شوند، پس چندين ست آغازگر بايد تست شوند.

8)  طراحي آغازگر بايد براساس توالي واقعي اسيد نوکلئيک ها صورت بگيرد. پس اگر قابل دسترسي باشد از برنامه هاي کامپيوتري طراحي آغازگر استفاده شود.

9)  آغازگر ها بايد داراي 55 TM> باشند، در Tm به طور تقريبي به ازاء هر A يا T، 2 درجه سانتي گراد و به ازاء هر G يا C، 4 درجه سانتيگراد اضافه شده، اگر به حالت يونيزه استفاده شود (به ازاء کل بازهاي اضافي) در Tm، دما شرکت داده نمي شود، اما اگر آغازگر هاي فراوان و اضافي استفاده شود کمترين دماي TM محاسبه شده و از آن انجام PCR شروع مي شود.

10) تا جايي که امکان دارد، آغازگر ها با Tm مشابه طراحي شود.

11) آغازگر ها بايد نزديک 200 تا 2000 باز از هم فاصله داشته باشند، اگر کمتر باشد، محصولات خيلي به آساني با پرايمر-پرايمر اتصال پيدا مي کنند و اگر بلند تر باشد، محصولات با راندمان پائين تکثير مي شود.

12) از تواليهاي داراي Oligo(dt) در انتهاي ´3، از 13 اليگو(dt) با A، C يا G، به طرف انتهاي ´3 استفاده شود.

13) اتصال اشتباهي باز T با توالي هدف يا آغازگر، نسبت به ديگر بازها با سرعت و مقدار بيشتري صورت مي گيرد، بنابراين بهتر است که از T در انتهاي ´3 آغازگر براي ايجاد تمايز در DNA، اجتناب شود، براي اطمينان در بيشتر موارد سعي شود در انتهاي ´3 گيره GC باشد.

14) از تکرار سه يا تعداد بيشتري باز مشابه پشت سر هم جلوگيري شود.

 

در بسياري موارد لازم نيست که توالي آغازگر کاملا" مکمل توالي قالب هدف باشد، ناحيه اي در آغازگر که بايد با قالب هدف کاملا" جفت و اتصال پيدا بکند، انتهاي ´3 است. زيرا در اين انتهاي آغازگر، توسعه و تکثير به وسيله DNA-polymerase انجام گرفته و چسبيدن درست به توالي هدف براي عمل کردن اختصاصي بسيار مهم است. عموما" بايد اولين سه نوکلئوتيد انتهاي ´3 کاملا" با قالب هدف جفت شود. انتهاي ´5 آغازگر در تعين اختصاصي بودن و چسبيدن به توالي هدف اهميت کمتري داشته و ممکن است که اين تواليها در بعضي روشها به منظور آسان کردن کلن کردن، دستکاري، موتاژنز، نوترکيبي يا ظهور مجدد در محصولات PCR، تغير بکند. تغيرات معمولي سايتهاي محدود کننده اي را ايجاد کرده که محصولات تکثيري بتواند در ناقلهاي دلخواه به سادگي و با کارائي بالا کلن بشوند. سايتهاي محدود کننده اندونوکلئاز به سادگي مي تواند به انتهاي ´5 اضافه شود و يا مي تواند در طول با آغازگر تغير يک يا تعداد بيشتري نوکلئوتيد توليد بشود. در اين طرح ما از نرم افزار Oligo 5 استفاده شد.

 

Melting temperature(Tm)

Tm دمايي است که در آن نیمی از آغازگر به ناحيه هدف مي چسبند و به عنوان شاخصي براي دماي annealing در PCR است. ساده ترين روش براي اندازه گيري Tm در پرايمرهاي بالاي 200 نوکلئوتيد فاصله، براساس اضافه شدن هر تعداد نوکلئوتيد در پرايمر با استفاده از فرمول زير محاسبه مي شود.

] 2*) تعداد+ (A+T 4*) تعداد  Tm=[(G+C

انجام طراحي آغازگر براي هيبريداسيون اساسا" در 1 مول نمک صورت مي گيرد و اين به طور معني داري بيشتر از آنچه است که در PCR استفاده مي شود. اولين PCR را در دماي Annealing، 5 درجه زير مقدار Tm محاسبه شده قرار دهيد.

 

منابع مورد استفاده:

 

نقوي، م.، قره يازي.ب.، حسيني سالکده.ق.، 1384. نشانگرهاي مولکولي، موسسه انتشارات و چاپ دانشگاه تهران

مصباح.س.ع.، کارگاه بازآموزي و آموزش عملي روشهاي بيوشيمي عمومي و باليني، مهرماه 81، گروه بيوشيمي باليني، دانشگاه تربيت مدرس

 

Mcpherson,M.J., and Moller,S.G.,2000, PCR, Bios Scientific Publishers Limited

 

جمع آوري: عزيزي

استخراج DNA از گياه و قارچ

 

 

  

  را مطابق دستور زير تهيه مي كنيم:

TESS 1- اول بافر

A: Tris NaoH( or HCl )………..100 mM

B: EDTA………………………..1mM

C: NaCl…………………………50mM

D: SDS…………………………2%

 

2- حدود 3 گرم بافت برگ گياه در ازت مايع با هاون خرد شود.

 

3- مقداري از بافت خرد شده (حدود 2/0 گرم ) را داخل تيوب 5/1 سي سي ريخته و به آن ( 1/0 تا 3/0 حجم تيوب ) اضافه مي كنيم.  TESS  500  ميكروليتر بافر استخراج

 

4- به مدت 10 دقيقه در دماي اتاق روي شيكر به هم بخورد.

 

5- بعد از هم خوردن به مدت 10 دقيقه به آن 150 ميكروليتر استات پتاسيم 5 مولار اضافه مي كنيم و دوباره روي شيكر به مدت 5 دقيقه قرار مي دهيم (در دماي اتاق).

 

6- بعد از به هم خوردن سانتريفيو‍‍‍ژ تيوبها به مدت 4 دقيقه و با سرعت 7000 دور انجام مي گيرد.

 7- بعد از سانتريفيوژ، فاز رويي تيوپ را به تيوپ جديد منتقل كرده و رسوب بافت گياهي را از آن حذف مي كنيم.

8- به فاز رويي سانتريفيوژ در تيوپ جديد، هم اندازه حجم خود آن الكل 96% اضافه كرده و به آرام چند بار به هم زده تا باهم مخلوط شده و بعد به مدت 20 دقيقه در فريزر 20- قرار  مي دهيم.

9- در مرحله بعد، از فريزر بيرون آورده و سانتريفيوژ دوم  آنرا با 14000 دور و مدت 6 دقيقه انجام مي دهيم.

 در ته تيوپ را باDNA10- بعد از اتمام سانتريفيوژ فاز رويي را سريعا" خالي كرده و پليت  اتانول 70% شستشو مي دهيم ( هر بار با 100 ميكرو ليتر).

 

11- بعد از شستشو سر تيوبها را به مدت نيم ساعت باز گذاشته تا خشك شوند و بعد به هر  يا آب مقطر اضافه مي كنيم.TE كدام از آنها 100 ميكروليتر بافر

 

 

 

 

 

 

توليد بذور سيب زميني عاري از ويروس‏هاي بيماريزاي گياهي

                         پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي

سطح زير كشت سيب‏زميني در كشور حدود 167 هزار هكتار مي‏باشد. در كشت سيب‌زميني در تمامي اراضي كشور از غده‏هاي بذري استفاده مي‌شود.كيفيت غده بذري از نظر فيزيولوژيكي و سالم بودن آن تاثير بسزايي در افزايش ميزان محصول دارد. عمده‏ترين مشكل غدد بذري سيب‏زميني، آلودگي به ويروس‏هاي گياهي مي‏باشد. گسترش آلودگي‏هاي ويروسي به علت استفاده از بذر آلوده باعث افزايش ميزان خسارت وارده به مزارع سيب‏زميني مي‏شود. استفاده از بذر سالم حداقل باعث 30 درصد افزايش محصول مي‏شود، با اين افزايش، ميزان توليد در كشور از 3 ميليون تن به 5/4 ميليون تن افزايش خواهد يافت.پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي با اجراي پروژه اي توليدي اقدام به توليد بذر عاري از ويروس سيب زميني نموده كه با توليد بذور مذكور، قدم مهمي به سوي خودكفايي در تهيه بذر سيب‏زميني عاري از ويروس‏هاي گياهي برداشته خواهد شد.

توليد اولين گياه پنبه تراريخته در كشور

در حال حاضر بيماري قارچي ورتيسيليوم (Verticillium dahlia) از مشكلات اصلي زراعت پنبه در مناطق مرطوب مي‏باشد. ضدعفوني خاك با گاز متيل برومايد موجب از بين رفتن بيماري مي‌شود ولي هزينه اين روش بسيار زياد بوده و اثرات زيان باري نيز روي موجودات خاكزي دارد، همچنين آلودگي محيط زيست را نيز به همراه دارد. يكي از سازوكارهاي مبارزه با اين بيماري توليد ارقام مقاوم از طريق مهندسي ژنتيك است. بدين منظور پلاسميد حاوي ژن كيتيناز در پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي  تهيه و توسط اگروباكتريوم به پنبه منتقل شد.همچنين‌كرم غوزه نيز كه يكي از مهمترين آفات پنبه كشور محسوب مي‌شود و هر سال بطور متوسط براي مبارزه با اين آفت 400 تن سم مصرف مي‌شود مورد توجه بوده است. به منظور كنترل كرم غوزه ژن مقاومت به كرم غوزه تحت عنوان ژن cry1Ab از باكتري باسيلوس تورينجينسيس جدا و با استفاده از تكنيك آگروباكتريوم وارد گياه پنبه شد. تمام لاروهاي مذكور كه بر روي اين گياهان قرار گرفتند در مدت كمتر از دو روز قبل از ايجاد هر نوع خسارتي مرده و از بين رفتند. بنابراين با استفاده از اين رقم مقاوم تا حدود زيادي هزينه توليد كاهش مي‌يابد و از همه مهمتر به دليل كاهش مصرف آفت كش‌ها و قارچ كش‌ها باعث حفظ محيط زيست مي‌شود.   موسسه تحقیقات بیوتکنولوژی

روش اختصاصی استخراج DNA از Xanthomonas spp

The cultures were grown in 5 ml nutrient broth (Difco) with 10% glycerol v/v (suggested by Maringoni et al. (1988) to avoid xanthan formation) for 72h at 27^oC. One tube of 1.5 ml was used to centrifuged the cells at 13,000 x g for 5 min and the pellet was suspended in 200 ml Tris 0.1 mol L^-1 and added with 200 ml of lysis solution (NaOH 0.2 N and 1% SDS), mixed and deproteinazed with 700 ml of phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1 v/v/v), homogenized and centrifuged 10 min at 13,000 x g .To precipitate DNA, 700 ml of cold 95% ethanol was added and spinned, washed in 70% ethanol and centrifuged. Precipitated DNA is dried at room temperature and suspended in 100 ul of water. The method described by Ausubel et al. (1992) was performed comparing twelve strains. The samples from the both methods were electrophoresed on 0.8% agarose gels, stained with ethidium bromide and photographed under UV light . The RAPD was performed according to Williams et al. (1990) using primer OPL 11 (Operon Technologies, USA).

مواد مورد نياز AFLP

1-   نمونه DNA (250 تا 300 نانوگرم)

2-   آنزيم Tru9I از شرکت Roche

3-   آنزيم PstI از شرکت Roche

4-   بافر OPA (100 ميکروليتر از استات منيزيمmM50+ 250 ميکروليتر استات پتاسيم mM250+ 50 ميکروليتر تريس استات mM50 به يک ميلي ليتر رسانده شود و در 20- نگهداري شود)

5-   آداپتورهاي MseI و PstI

1)MseI-1: 5' -gAC gAT gAg TCC TgA g-3'

2)PstI-1:   5 '-gAC TgC gTA ggT gCA-3'

#1,2 should be dephosphorilated in 5'end.

 

3)MseI-2: 5' -TAC TCA ggA CTC AT-3'

4)PstI-2:   5' -CCT ACg CAg TCT ACg Ag-3'

 Roche از شرکت ATP 6-

7- T4 DNA Ligase از شرکت Roche

8- پرايمر هاي M000 و P000

P000:   5'-gAC TgC gTA ggT gCA g-3'

M000:  5'-gAT gAg TCC TgA gTA A-3'

9- پرايمرهاي M و P با سه نوکلئوتيد انتخابي

   PstI primers

1)   5'-gAC TgC gTA ggT gCA gAAA-3'

2)   5'-gAC TgC gTA ggT gCA gAAC-3'

3)   5'-gAC TgC gTA ggT gCA gAAg-3'

4)   5'-gAC TgC gTA ggT gCA gAAT-3'

5)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA gACA-3'

6)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA gACC-3'

7)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA gACg-3'

8)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA gACT-3'

9)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA gAgA-3'

10)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA gAgC-3'

11)   5'-gAC TgC gTA ggT gCA gAgg-3'

12)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA gAgT-3'

13)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA ggCA-3'

14)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA ggCC-3'

15)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA ggCG-3'

16)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA ggCT-3'

17)  5'-gAC TgC gTA ggT gCA ggTA-3'

MseI Primers

1) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAA A-3'

2) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAA C-3'

3) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAA g-3'

4) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAA T-3'

5) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAC A-3'

6) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAC C-3'

7) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAC g-3'

8) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAC T-3'

9) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAg A-3'

10) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAg C-3'

11) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAg g-3'

12) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAg T-3'

13) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAT A-3'

14) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAT C-3'

15) 5'-gAT gAg TCC TgA gTA AAT g-3'

10- dNTPs و  بافر PCR از شرکت Roche

11- آنزيم Tag DNA Polymerase از شرکت Roche

12- MgCl₂ از شرکت Roche

13- Bind (γ-Methacryloxypropyl trimethoxysilane) از شرکت سيگما

14- Sigmacote از شرکت سيگما

15- الکل 96 درجه

16- اسيد استيک

17- اکريل آميد و بيس اکريل آميد از شرکت مرک

18- اوره از شرکت مرک

19- Trise، EDTA و بوريک اسيد (براي تهيه TBE بافر)

20- TEMED از شرکت مرک

21- Ammonium peroxodisulfate از شرکت مرک

22- تيوسولفات سديم از شرکت مرک

23- Formamide از شرکت مرک

24- Formaldhyde از شرکت مرک

25- بي کربنات سديم (Na₂Co₃) از شرکت مرک

26- نيترات نقره (AgNo₃) از شرکت مرک

27- NaOH

28- آگاروز